1、课题2 多聚酶链式反应扩增DNA 片段 一、PCR原理与条件 1.PCR的概念:PCR即_,是一种体外迅速扩增_的技术。它能以极少量的DNA 为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。必备知识自主学习 多聚酶链式反应 DNA片段 2.细胞内DNA复制的基本条件:参与的组分在DNA复制中的作用_打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的_4种_合成子链的原料_催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的 _端开始连接脱氧核苷酸解旋酶 模板 脱氧核苷酸 DNA聚合酶 3 3.PCR原理:(1)DNA变性:在_的温度范围内,DNA 的_将解体,双链分 开。(2)DNA复性:当温度缓慢降低后,两
2、条彼此分离的_又会重新结合成双 链。(3)子链的合成:DNA 聚合酶从引物的_开始延伸DNA 链。80100 双螺旋结构 DNA 链 3端 4.PCR条件:(1)原料:_。(2)模板:加热变性解旋后的_条DNA母链。(3)酶:_。(4)引物:使DNA 聚合酶能够从引物的_开始连接脱氧核苷酸。(5)其他条件:需要稳定的_和能自动调节温度的温控设备等。4种脱氧核苷酸 两 耐高温的DNA聚合酶 3端 缓冲溶液 二、PCR过程与结果 1.PCR过程:过程温度主要变化变性_ 双链DNA解旋为_复性_ _通过碱基互补配对分别与两条_ 结合延伸_ 溶液中的四种脱氧核苷酸(A,T,G,C)在_ 的作用下,遵循
3、_原则合成新的DNA链95 单链 55 两种引物 单链DNA 72 DNA聚合酶 碱基互补配对 2.PCR的结果:DNA聚合酶只能特异地复制处于_的DNA序列,使这段 固定长度的序列呈_扩增。两个引物之间 指数 三、PCR实验操作 1.实验用具:名 称作 用PCR仪自动调控_,实现DNA的扩增微量离心管实际上是进行PCR反应的_微量移液器用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体,每吸取一种 试剂后,其上的枪头都必须_温度 场所 更换 2.实验步骤:(1)准备:按照PCR反应需要的物质和条件,将需要的试剂和仪器准备好。(2)移液:用_按照配方在微量离心管中依次加入各试剂。(3)混合:盖严微量离心
4、管口的盖子,用手指轻弹_,使反应液混合均匀。(4)离心:将微量离心管放在离心机上,离心约10 s,使反应液集中在_。(5)反应:将离心管放入_中进行反应。3.DNA含量的测定:(1)测定原理:DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与_ _有关。(2)计算方法:DNA含量(g/mL)=_稀释倍数。微量移液器 管的侧壁 离心管底部 PCR仪 DNA含 量 50(260 nm的读数)【易错辨析】1.DNA聚合酶只能从引物的3 端延伸DNA链,因此DNA合成的方向总是从子链的 5端向3 端延伸。()2.PCR的每次循环依次为变性、延伸、复性。()分析:PCR技术分为变性、复性和延
5、伸三步。3.PCR反应中缓冲液的作用类似生物体内内环境的作用。()分析:内环境的稳态可以保证细胞的生命活动正常进行。4.高压灭菌的微量移液器枪头每吸取一种试剂后不需要更换。()分析:为避免外源DNA等因素的污染,在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一 种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。5.PCR过程与细胞内的DNA复制一样,都是边解旋边复制的过程。()分析:PCR利用DNA热变性原理,当温度升高到90 以上时,DNA双螺旋结构全部 打开,因此PCR过程是全解旋复制。关键能力合作学习 一、细胞内DNA复制与PCR扩增的比较 项 目 细胞内DNA复制 PCR扩增 不同点 时间 有丝分裂间期和减数
6、 第一次分裂前的间期 人工控制 随时进行 场所 细胞内 细胞外(PCR仪)解旋 解旋酶 高温变性 合成酶 DNA聚合酶 耐热的DNA 聚合酶 特点 边解旋边复制 全解旋复制 循环次数 生物体自身控制 30多次 项 目 细胞内DNA复制 PCR扩增 不同点 pH 生物体自我调控 缓冲液 温度 环境影响或体温调节 PCR仪或不同温 度的水浴锅 相同点 原料 四种脱氧核苷酸 原则 严格遵循碱基互补配对原则 模板 DNA为模板 方式 半保留复制 引物 都需要与模板相结合的引物 易错提醒:与PCR原理有关的三个易错点(1)酶的作用位点:解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开;DNA聚合酶与DNA连接
7、酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶和DNA连接酶:DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上,需要模板;而DNA 连接酶连接的是两条DNA 片段的缺口,不需要模板。(3)PCR中的解旋过程:PCR过程中不需要解旋酶,需要升高温度才能打开氢键,但此时的温度不会破坏磷酸二酯键,因此,DNA加热变性后变为单链,并未分解成单体。【选修对接必修】对接必修2:DNA的结构(1)DNA具有双螺旋结构,碱基对之间遵循_原则,依靠_连接。(2)DNA的两条链是_平行的,DNA的羟基端称为_端,磷酸基团的末端称为 _端。对接必修2:DNA的复制(1)
8、PCR过程中DNA的解旋依靠高温,细胞内的DNA解旋需要_。(2)TaqDNA聚合酶具有_的特点,其功能是_ _。碱基互补配对 氢键 5 解旋酶 耐高温 催化脱氧核苷酸之间形成磷 酸二酯键 反向 3【典题通关】PCR技术是生物体外的特殊DNA复制技术,其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。请回答有关问题:(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA,而PCR技术中应用_。(2)PCR技术所需的TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的,说明该酶能耐_。在热泉中只生活着Taq细菌,从生物进化角度解释原因是_。(3)与体内DNA复制相比较,PCR反应要在_中才能进行,并且要严格控制_条件
9、。(4)PCR中加入的引物有_种,加入引物的作用是_。【解题关键】解答本题的关键是:(1)明确细胞内DNA复制与PCR技术的解旋原理不同。(2)明确PCR技术通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。【解析】(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开,从而解旋。(2)Taq细菌具有耐高温的特性,在高温环境下,其他绝大多数细菌死亡,而Taq细菌得以保留。(3)PCR反应是在一定的缓冲溶液中进行的,并需严格控制好温度条件。(4)PCR中加入的引物有2种,使RNA聚合酶从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键,成为DNA复制的起点。答案:(1)高温使DNA分子
10、热变性(2)高温 热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物(3)一定的缓冲溶液 温度(4)2 作为DNA复制的起点【误区警示】(1)误认为PCR技术需要耐高温的解旋酶,实际是靠高温解旋,而所需的TaqDNA聚合酶能耐高温。(2)误认为PCR技术只需要1种引物,实际上DNA复制是双向的,需要2种引物。【跟踪小练】1.PCR技术扩增DNA,需要的条件是()目的基因 引物 四种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 mRNA 核糖体 A.B.C.D.【解析】选A。在目的基因的核苷酸序列已知的情况下,可利用PCR技术扩增目的基因。PCR全称为多聚酶链式反应,是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。其原理是D
11、NA复制,需要一定的条件,包括模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。2.2019年3月10日,从埃塞俄比亚首都飞往肯尼亚首都的ET302航班在飞行途中坠毁,机上157人无一生还。在辨认遇难者遗体时需进行DNA鉴定,鉴定时采用PCR技术能有效解决样品中DNA含量较少的问题。请分析回答:(1)遇难者生前体内DNA复制过程中,利用解旋酶打开双链DNA,而PCR技术中的解旋原理是_。(2)PCR技术需要一种Taq DNA聚合酶,该酶是从_中分离的。(3)与普通DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶具有的特性是_。【解题关键】关键有以下两点:(1)PCR技术与
12、细胞内的DNA复制的异同点。(2)Taq DNA聚合酶的来源与特性。【解析】(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开,从而解旋,其原理是DNA的热变性原理。(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。(3)与普通DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不变性,具有耐高温的特性。答案:(1)DNA的热变性(2)水生耐热细菌Taq(3)耐高温 【互动探究】细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗?若需要,是如何实现的?提示:需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关,低等生物与环境因素有关。二、PCR反应 1.PCR中的环节:温度控制目的预变性90 以上
13、增加大分子模板DNA彻底变性的概率循环变性 复性 延伸95 使双链DNA解聚为单链 55 两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 72 在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 2.PCR反应过程图解:(1)第一次循环示意图:(2)PCR扩增的结果示意图(如图):3.PCR扩增的计算:理论上DNA呈指数扩增。(1)若开始只有一个DNA 提供模板,则循环n 次后获得的子代DNA数目为2n个。(2)若开始有N0个DNA 提供模板,则循环n 次后获得的子代DNA数目为N02n个。4.DNA含量的测定:(1)测定原理:DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,其峰值的
14、大小与DNA含量有关。(2)测定方法:稀释:取2 L PCR反应液,加入98 L蒸馏水,将样品进行50倍稀释。对照调零:以蒸馏水作为空白对照,在波长260 nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零。测定:取DNA稀释液100 L至比色杯中,测定260 nm处的光吸收值。计算:DNA含量(g/mL)=50(260 nm的读数)稀释倍数。易错提醒:PCR过程的两点提醒(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时,引物与DNA模板的结合是随机的,也存在DNA解开的两条链的结合。(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物,比所需的DNA片段要长,从第二次
15、循环才出现所需的DNA片段,这样的片段存在两种引物。【典题通关】PCR技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术,如图表示合成过程,回答下列问题。(1)A过程高温使DNA变性解旋,该过程破坏了碱基对之间的_。(2)C过程要用到的酶是_。这种酶在高温下仍保持活性,因此在PCR扩增时可以_加入,_(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外,还需要满足的基本条件有_。(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记,游离的脱氧核苷酸不做标记,控制“95 55 72”温度循环3次,则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占_。(4)如果模板DNA分子共有a个碱基对,其中含有胞嘧啶
16、m个,则该DNA复制10次,需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸_个。(5)PCR中由碱基错配引起的变异属于_。假设对一个DNA进行扩增,第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配,则扩增若干次后检测所用DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占_。【解题关键】解答本题的关键是:(1)辨认图中PCR技术每一循环的三个过程。(2)依据DNA的半保留复制特点进行相关计算。【解析】(1)高温所起的作用类似于解旋酶,破坏氢键,使双链DNA变为单链。(2)C过程为PCR技术的延伸阶段,当系统温度上升至72 左右,溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。TaqDNA聚合酶是耐热的,高温下不
17、变性,所以一次性加入即可。(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过3次循环,共产生23个DNA分子,其中有2个DNA分子含有15N标记。(4)在一个双链DNA分子中,C+T占碱基总数的一半,故T的数目为a-m,复制10次,相当于新增加了(210-1)个DNA分子。故需补充T的数目为(210-1)(a-m)。(5)基因中的碱基对改变属于基因突变。对一个DNA进行扩增,第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配,第二次以后按正常配对方式进行扩增,错配链作模板扩增的都是错误的DNA分子,原正常链扩增得到的DNA分子都是正常的DNA分子,故若干次后检测所用DNA的扩增片段,与原DNA相应片段相同的占3/
18、4。答案:(1)氢键(2)TaqDNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、适当的温度(3)25%(4)(210-1)(a-m)(5)基因突变 75%【方法规律】PCR产物的数量(以1个DNA分子经n次循环扩增的产物分析)(1)PCR扩增得到的DNA分子总数量:2n。(2)含有原始母链的DNA分子只有2个。【跟踪小练】PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,下列有关PCR过程的叙述,错误的是 ()A.变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键 B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的 C.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 D.PCR与细胞内DNA复制相比,所需要的酶的最适温度较高 【解析】选C。DNA的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键,使双链DNA得以打开,故A正确;引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的,故B正确;PCR反应的产物是DNA,因此原料是四种游离的脱氧核苷酸,不是核糖核苷酸,故C错误;PCR是在较高温度条件下进行的,该过程需要热稳定DNA聚合酶,故D正确。