1、专题1 基因工程第四十七课时基因工程的基本工具、基因工程的基本操作程序1.基因工程的诞生 2.基因工程的原理及技术考点一 基因工程的理论基础和基本工具【回扣教材】1基因拼接的理论基础(1)_是主要遗传物质。(2)DNA 的基本组成单位都是_。(3)双链 DNA 分子的空间结构都是规则的_结构。DNA四种脱氧核苷酸双螺旋2外源基因在受体内表达的理论基础(1)_是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循_。(3)生物界共用一套_。3基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶：切割 DNA 的工具是_，又称_。这类酶主要是从_中分离纯化出来的，能识别_分子中_，并且使每一条链中特定部位的
2、两个核苷酸之间的_断开，使其形成_或_。基因中心法则遗传密码限制性核酸内切酶限制酶原核生物双链DNA特定的核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端(2)DNA 连接酶：常用的 DNA 连接酶有E.coli DNA连接酶来源：大肠杆菌作用特点：只连接_ T4DNA 连接酶来源：T4噬菌体作用特点：连接_(3)载体：携带目的基因进入受体细胞条件：能在宿主细胞中保存下来并大量_，有一个至 多 个 _ 切 割 点，有 特 殊 的 遗 传_，便于筛选。种 类：_(常 用)、噬 菌 体 的 衍 生 物、_。质粒是能够自主复制的双链小型环状_分子。复制限制性核酸内切酶标记基因质粒动植物病毒DNA黏性末端黏性末端和
3、平末端作用：作为运载工具，将_转移到宿主细胞内；利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量_。目的基因复制【知识拓展】基因工程的别名基因拼接技术或 DNA重组技术 操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA 分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的新的生物类型和生物产品 2.DNA 连接酶与 DNA 聚合酶的比较DNA 连接酶DNA 聚合酶 作用实质都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键 是否需模板不需要需要连接 DNA 链单链单链 作用过程在两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的 3端的羟基上，形成磷酸二酯键 作用结果将存在的 DNA片段连接成重组 DNA 分子
4、合成新的 DNA 分子【典例精析】【例 1】下列有关基因工程叙述错误的是()A基本原理是 DNA 具有双螺旋结构以及遗传信息传递和表达方式相同B最常用的载体是质粒C工具酶主要有限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶D该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换【解析】基本原理是 DNA 具有双螺旋结构以及生物共用一套遗传密码子，A 错误；基因工程中最常用的载体是质粒，B 正确；基因工程所用工具酶主要有限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶，C 正确；基因工程技术能人为地增了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换，D 正确。A考点二 基因工程基本操作程序【回扣教材】基因工程的基本操作程序第一
5、步：_1目的基因主要是指_，也可以是一些具有调控作用的因子。目的基因的获取途径常 见 的 有：_、_、_。目的基因的获取编码蛋白质的结构基因从自然界中已有的物种中分离出来人工合成目的基因利用PCR技术扩增目的基因2基因文库：将含有某种生物不同基因的许多_导入_的群体中储存，各个_分别含有这种生物的_，称为基因文库。常见的基因文库有_和_。3PCR技术扩增目的基因PCR是_的缩写，是一项在_复制特定DNA片段的核酸合成技术，可以在短时间内_。其原理是_，其过程是：加热至9095，_；冷却到5560，_；加热至7075_。DNA片段受体菌受体菌不同的基因基因组文库cDNA文库聚合酶链式反应生物体外
6、大量扩增目的基因DNA双链复制DNA解旋引物结合到互补DNA链热稳定DNA聚合酶(如Taq酶)从引物起始进行互补链的合成第二步：_1目的：使目的基因在受体细胞中_，并且可以 _，同 时 使 目 的 基 因 能 够_。2基因表达载体的组成：_(1)启动子：是一段有特殊结构的_，位于基因的首端，是_识别和结合的部位，能驱动基因_，最终获得所需的蛋白质。(2)终止子：是一段有特殊结构的_，位于基因的_。(3)标 记 基 因 的 作 用：是 为 了 鉴 定 受 体 细 胞 中_，从而将_筛选出来。常用的标记基因是_。基因表达载体的构建稳定存在遗传给下一代表达和发挥作用启动子目的基因终止子标记基因DNA
7、片段RNA聚合酶转录出mRNADNA短片段尾端是否含有目的基因含有目的基因的细胞抗生素抗性基因第三步：_1转化的概念：是目的基因进入_，并且在受体细胞内_的过程。2常用的转化方法：(1)将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是_，农杆菌特点：易感染_植物和裸子植物，对大多数_植物没有感染力；农杆菌中的Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的_上。其次还有_，是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。将目的基因导入受体细胞受体细胞内维持稳定和表达农杆菌转化法双子叶单子叶染色体的DNA基因枪法_，是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法(我国的转基因抗虫棉就是
8、用此种方法获得的)。(2)将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是_。此方法的受体细胞多是_。操作程序：目的基因表达载体_取卵(受精卵)显微注射注射了目的基因的受精卵移植到_性动物的_内发育新性状动物。花粉管通道法显微注射技术受精卵提纯雌输卵管或子宫(3)将目的基因导入微生物细胞：感受态细胞法 原 核 生 物 特 点：_、_、_等，因此早期的基因工程都用原核生物作为受体细胞。大肠杆菌最常用的转化方法是：_处理细胞 _ 细 胞 表 达 载 体 与 感 受 态 细 胞 混 合_细胞吸收DNA分子。3重组目的基因导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是_。繁殖快多为单细胞遗传物质相对较少C
9、a2感受态感受态标记基因是否表达第四步：_1首先要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，方法是_。2其次还要检测_，方法是_。3最后检测_，方法是从转基因生物中提取_，用相应的抗体进行_。4有时还需进行_的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。目的基因的检测与鉴定DNA分子杂交技术目的基因是否转录出了mRNA用标记的目的基因作探针与mRNA杂交目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质抗原抗体杂交个体生物学水平【知识拓展】1将目的基因导入受体细胞的比较生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞 常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞 转化过程将目的基因插入 Ti 质
10、粒的 TDNA 上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA 中表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA 分子 2.目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法结果显示 分子检测导入检测目的基因是否插入受体细胞染色体的 DNA上DNA 分子杂交技术(DNA和 DNA 之间)是否成功显示出杂交带表达检测目的基因是否转录出 mRNA核酸分子杂交技术(DNA和 mRNA 之间)同上 目的基因是否翻译出蛋白质蛋白质分子杂交(抗原与抗体之间)同上 个体生物学水平的鉴定确定是否具有抗性及抗性程度基
11、因工程产品与天然产品的活性是否相同 抗 虫 或 抗病 的 接 种 实验 基 因 工 程产 品 与 天 然产 品 活 性 的比较是否赋予了预期抗性或蛋白质活性【典例精析】【例 2】(2015 北京卷)在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是()A用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞B用选择培养基筛选导入目的基因的细胞C用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合D用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽C【解析】培育转基因植株的主要步骤：a.目的基因的获取b.构建基因表达载体c.将目的基因导入受体细胞d.目的基因的检测与鉴定。A 项，将目的基因导入植物细胞常采用农杆菌转化
12、法，属于 c 步骤。B 项，目的基因导入受体细胞后，需要检测其是否可以稳定维持和表达，属于 d 步骤。C 项，用聚乙二醇诱导原生质体融合是细胞融合技术的必要手段，但不是基因工程的常规步骤。D 项，获得导入了目的基因的受体细胞后，需要经植物组织培养才能发育成植株，植物组织培养过程中需要用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织分化生成根和芽，属于必需步骤。课时练习四十七一、选择题(每小题只有一个正确选项)1下列关于基因工程的叙述中，错误的是()A首先要获取目的基因，然后要让目的基因与运载体结合B一般用同一种限制性内切酶切割质粒和获取目的基因C目的基因导入受体细胞后可以随着受体细胞的繁殖而复制D一
13、次基因工程操作中，能够摄入重组 DNA 分子的受体细胞很多D【解析】首先要获取目的基因，然后要让目的基因与运载体结合，构建基因表达的载体，A 项正确；同一种限制性内切酶切割质粒和获取目的基因，形成相同的黏性末端，B 项正确；目的基因导入受体细胞后可以随着受体细胞的繁殖而复制，实现遗传信息的传递，C 项正确；基因工程操作中，有重组 DNA 分子的受体细胞、非重组 DNA 分子的受体细胞、不含运载体的受体细胞，其中含重组 DNA 分子的受体细胞很少，D 项错误。2右图为某质粒的示意图，其中 ori 为复制必需的序列，amp 为氨苄青霉素抗性基因，tet 为四环素抗性基因，箭头表示目的基因的插入位点
14、。实验中可能有的受体细胞(某种细菌，该细菌无相关的抗性基因)没有导入质粒，有的细胞导入的质粒没有连接到目的基因(空载质粒)。为了筛选出真正导入了重组质粒的受体细胞，科学家将受体细胞分别培养在含四环素的培养基中，有的培养基形成了菌落。从每个菌落中挑取少量菌种分别接种到含氨苄青霉素的培养基中，有的培养基无菌落产生。下列分析正确的是()A在含四环素的培养基中未形成菌落的为导入了空载质粒的细菌DB在含四环素的培养基中形成菌落的为导入了重组质粒的细菌C在含氨苄青霉素的培养基中能正常生长的为导入了重组质粒的细菌D在含氨苄青霉素的培养基中不能正常生长的为导入了重组质粒的细菌【解析】在含四环素的培养基中未形成
15、菌落，说明无四环素抗性基因，即未导入质粒；在含四环素的培养基中形成菌落，说明有四环素抗性基因，即导入了重组质粒或空载质粒；在含氨苄青霉素的培养基中能正常生长，说明相关的抗性基因未被破坏，即导入了空载质粒；在含氨苄青霉素的培养基中不能正常生长，而在含四环素的培养基中可以生长，说明有四环素抗性基因无青霉素抗性基因，即导入了重组质粒。3在基因表达载体的构建中，下列说法正确的是()A一个表达载体的组成只包括启动子、终止子B只有存在启动子才能驱动基因转录出 mRNAC基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的D终止密码子的作用是使转录在所需要的地方停止B【解析】基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，一
16、个表达载体的组成，除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等，A 错误；启动子在基因的首段，它是 RNA 聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始，B 正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，C 错误；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束，而终止密码子是存在于 mRNA 上的，D 错误。4下列对基因工程的四大操作步骤的理解有错误的一项是()A限制性核酸内切酶主要存在于原核生物体内，识别位点具有特异性BDNA 连接酶是恢复被切开的两条脱氧核苷酸链之间的化学键C目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些有调控作用
17、的因子D目的基因的检测与鉴定的过程中只能用含青霉素的选择培养基D【解析】限制性内切酶主要存在于原核生物体内，识别位点具有特异性，A 正确；DNA 连接酶是连接被切开的两条脱氧核苷酸链之间的磷酸二酯键，B 正确；目的基因是指能编码蛋白质的基因，或调控作用的因子，C 正确；目的基因的检测与鉴定的过程中只能用含抗生素的选择培养基，D 错误。5人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是()A提高受体细胞在自然环境中的耐药性B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接B【解析】在基因工程中，往往选择的质粒会带有一定的抗性基因，抗性基因的主要
18、作用是有利于检测目的基因是否导入到受体细胞了。答案选择 B。6获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取常用的方法是()A从基因组文库中获取 B从 cDNA 文库中获取C从含目的基因生物细胞中获取 D利用 PCR 技术获取C【解析】获得目的基因的常用方法是：从基因文库(基因组文库和 cDNA 文库)中获取；利用 PCR 技术扩增；人工合成(化学合成)；从含目的基因生物细胞中获取，其目的性不强，且工作量大，一般不采用。综上所述，A、B、D 三项均错误，C 项正确。7如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中 Pst、Sma、EcoR、Apa为四种限制性内切酶
19、。下列说法错误的是()A图示过程是基因工程的核心步骤B表达载体构建时需要用到限制酶 SmaC抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构B【解析】图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶 Pst、EcoR。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。8目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞是
20、否有目的基因 检测受体细胞是否有致病基因 检测目的基因是否转录 检测目的基因是否翻译出蛋白质 ABCDC【解析】目的基因检测和鉴定，首先要检测转基因生物染色体的 DNA 上是否插入了目的基因，即检测受体细胞是否有目的基因，正确；其次要检测目的基因是否转录出 mRNA，正确；最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，正确；致病基因不属于目的基因，与目的基因的检测和鉴定无关，错误。综上所述，供选答案组合，C 项正确，A、B、D 三项均错误。9下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法错误的是()图 1 图 2AA一个图 1 所示的质粒分子经 Sma
21、切割后，含有 4 个游离的磷酸基团B用图 1 中的质粒和图 2 中的目的基因构建重组质粒，不能使用 Sma切割C图 2 中为防止酶切后单个含目的基因的 DNA片段自身连接成环状，不能使用 EcoRD为了获取重组质粒，最好用 BamH和 Hind同时切割质粒和外源 DNA【解析】一个图 1 所示的质粒分子经 Sma切割后，含有 2 个游离的磷酸基团，A 项错误。10关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是()A将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是花粉管通道法B将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射技术C为使大肠杆菌易吸收 DNA 分子，应先用缓冲液进行处理D在显微注射技术中，不需先
22、构建基因表达载体B【解析】将目的基因导入植物细胞，常采用农杆菌转化法，A 错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最有效的方法，B 正确；为使大肠杆菌易吸收 DNA 分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使其成为感受态细胞，C 错误；在显微注射技术中，导入受体细胞的也是构建好的基因表达载体，D 错误。11下图是四种不同质粒的示意图，其中 ori 为复制必需的序列，amp 为氨苄青霉素抗性基因，tet 为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制性核酸内切酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是()A基因 amp 和 tet 是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因B质粒包括细菌细胞中能自我复制的小型环状的 D
23、NA 和病毒中的 DNAC限制性核酸内切酶的作用部位是 DNA 分子中特定的两个核苷酸之间的氢键D用质粒 4 将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长D【解析】质粒上不含等位基因；质粒是细胞染色体(拟核)外能够自主复制的很小的环状 DNA 分子；限制性核酸内切酶的作用部位是 DNA 分子中特定的两个相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，而不是氢键。12质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置(插入点有 a、b、c)，请
24、根据表中提供细菌的生长情况，推测三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()A细菌在含氨芐青霉素培养基上生长情况细菌在含四环素培养基上生长情况能生长能生长能生长不能生长不能生长能生长A.是 c；是 b；是 aB.是 a 和 b；是 a；是 bC.是 a 和 b；是 b；是 aD.是 c；是 a；是 b【解析】第组中细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是 c；第组中细胞能在含青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因被破坏，说
25、明了外源基因插入的位置是 b；第组中细胞不能在含青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是 a。二、非选择题13在对番茄的研究中发现，害虫损伤番茄叶片后，叶上的细胞壁能释放出一种类激素因子，这种物质能通过细胞组织扩散到茎和其他叶片上，启动蛋白质酶抑制剂基因后，开始高效合成蛋白酶抑制剂，并在茎叶中迅速积累，以对付害虫的再次侵袭。蛋白酶抑制剂对害虫的消化酶有抑制作用，因此害虫取食后，就会因无法消化食物而死亡。人们尝试着将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，让玉米获得与番茄相似的抗虫性状，以对付异常猖獗的玉米螟。(1
26、)将番茄的蛋白酶抑制剂基因截取及连接到玉米的 DNA 中用到的酶分别是和。(2)若检测该蛋白酶抑制剂基因是否成功转入，应采用法，若检测蛋白酶抑制剂基因是否表达，应采用技术。限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA分子杂交抗原抗体特异性反应(3)将番茄的蛋白酶抑制剂基因转入玉米细胞时，最常采用的方法是，除此之外还有和花粉管通道法等。(4)能抗玉米螟的抗虫玉米生态效益显著，有人认为抗虫玉米就是无虫玉米，不必防治害虫。你是否赞成这种说法？说明理由。；。农杆菌转化法基因枪法不赞成转基因玉米能抵抗玉米螟，但并不能抵抗所有的害虫14青蒿素是治疗疟疾的重要药物。研究人员已经弄清了青蒿细胞中青蒿素的合成途径(图中实
27、线方框内所示)，并且发现酵母细胞也能够产生合成青蒿素的中间产物 FPP(图中虚线方框内所示)。结合所学知识回答下列问题：(1)若利用植物组织培养技术进行青蒿素的工厂化生产，可将青蒿细胞经培养获得的细胞置于发酵罐中培养，青蒿细胞经方式实现细胞数目的增多并产生大量的青蒿素。愈伤组织有丝分裂(2)根据图示代谢过程，科学家在培育能产生青蒿素的酵母细胞过程中，需要向中导入，继而可利用技术检测目的基因是否导入受体细胞。(3)图中和过程无论发生在青蒿细胞中，还是发生在酵母细胞中，都能产生相同的物质 FPP，原因是。(至少写出 2 点)(4)实验发现，酵母细胞导入相关基因后，该基因能正常表达，但酵母菌合成的青
28、蒿素仍很少，根据图解分析原因可能是。酵母细胞ADS酶基因DNA分子杂交都具有FPP合成酶基因，FPP合成酶基因所携带的遗传信息相同；不同细胞中转录相同的模板链，转录和翻译过程中都遵循碱基互补配对原则，两种生物共用一套遗传密码，都具有底物IPP酵母细胞中部分FPP用于合成固醇【解析】(1)利用植物组织培养技术进行工厂化生产青蒿素时，通常从培养的愈伤组织中提取青蒿素，愈伤组织细胞增殖的方式是有丝分裂。(2)酵母菌细胞中缺乏合成青蒿素的 ADS 酶基因，基因工程中需将ADS 酶基因导入酵母细胞，可利用 ADS 酶基因片段制备的探针，通过 DNA 分子杂交技术检测目的基因是否导入受体细胞。(3)青蒿细
29、胞和酵母细胞中都具有FPP 合成酶基因，FPP 合成酶基因所携带的遗传信息相同；如果不同细胞中转录相同的模板链，转录和翻译过程中都遵循碱基互补配对原则，且两种生物共用一套遗传密码，则会合成出相同的 FPP 合成酶，都能催化 IPP 合成 FPP。(4)因为酵母细胞中存在 ERG9酶，会催化部分 FPP 合成固醇，导致 FPP 不能都用于合成青蒿素，所以酵母细胞导入相关基因后，该基因能正常表达，但酵母菌合成的青蒿素仍很少。15口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防，疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白 VP1。科学家尝试利用转基因细菌来生产口蹄疫疫苗，过程如
30、下图所示。请据图回答。(1)口蹄疫病毒的遗传物质为 RNA，过程用的方法合成 DNA，再用限制酶将 VP1 基因片段切下。(2)过程一般使用同一种限制酶切割目的基因和质粒，再用将两者连接成重组质粒，若只考虑两个 DNA 相连，过程会得到种连接产物。故过程之后需要进一步筛选。反转录DNA连接酶3(3)过程之后，应先将细菌分别培养在含的培养基中，未形成菌落的即为的细菌，然后从长出菌落的培养基中分别挑取少量菌种接种到多个含的培养基中，培养基(有、无)菌落产生即为导入了重组质粒的目的菌。(4)导入重组质粒的目的菌是否成功表达，还需用法进行检测。【解析】(3)未导入质粒即无四环素抗性基因，不能在含四环素
31、的培养基中生存；导入了自身连接的质粒时，既有青霉素抗性基因也有四环素抗性基因，故在两种培养基中都能生存；导入重组质粒时，只有四环素抗性基因，在含氨苄青霉素的培养基中不能生存。四环素未导入质粒氨苄青霉素无抗原抗体杂交16 1抗胰蛋白酶缺乏症是一种在北美较为常见的单基因遗传病，患者成年后会出现肺气肿及其他疾病，严重者甚至死亡。对于该病患者常可采用注射人 1抗胰蛋白酶来缓解症状。图 1(1)图 1 表示获取人 1抗胰蛋白酶基因的两种方法：a 过程是在酶的作用下完成的，该酶的作用特点是。限制性核酸内切识别特定的核苷酸序列，并在特定的节点上切割DNA分子c 过程称为，该过程需要的原料是。要确定获得的基因
32、是否是所需的目的基因，可以从分子水平上利用技术检测该基因的碱基序列。(2)利用转基因技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵，最终培育出能在乳腺细胞表达人 1抗胰蛋白酶的转基因羊，从而更易获得这种酶，简要过程如图 2。图 2获得目的基因后，常利用技术在体外将其大量扩增。逆(或反)转录4种脱氧核苷酸DNA分子杂交PCR载体上绿色荧光蛋白(GFP)基因的作用是便于。基因表达载体 d 除图中的标示部分外，还必须含有。若要使转基因羊的后代均保持其特有的性状，理论上应选用技术进行繁殖。17(2015 江苏卷)胰岛素 A、B 链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图 1 是该方法所用的基因表达载体，图 2 表
33、示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白 A、B 分别表示 半乳糖苷酶与胰岛素 A、B 链融合的蛋白)。请回答下列问题：图 1筛选含有目的基因的受体细胞启动子、终止子体细胞克隆或者核移植图 2(1)图 1 基因表达载体中没有标注出来的基本结构是。(2)图 1 中启动子是酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有。终止子RNA聚合作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来限制酶和DNA连接酶(4)半乳糖苷酶与胰岛素 A 链或 B 链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于。(5)
34、溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的 A 链或 B链，且 半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为。(6)根据图 2 中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是，理由是。防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸至少2个两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基【解析】(1)重组基因表达载体中应具有启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点。(2)启动子是转录过程中 RNA 聚合酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达。图中的氨苄青霉素抗性
35、基因充当了标记基因，可用含有氨苄青霉素的培养基筛选含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体时，一般用同种限制酶分别切割目的基因和载体，然后用 DNA 连接酶将目的基因和载体连接。(4)胰岛素肽链上具有蛋白酶的切割位点会导致胰岛素被菌体内的蛋白酶降解，而通过融合表达将切割位点隐藏在内部可防止胰岛素的 A、B 链被菌体内的蛋白酶降解。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，并结合半乳糖苷酶被切成多个肽段，获得了完整的胰岛素 A 链、B 链，由此可以推测 半乳糖苷酶中必然含有多个甲硫氨酸，胰岛素 A 链、B 链不含甲硫氨酸。(6)每一条肽链的两个末端分别含有一个氨基和一个羧基，某些氨基酸的 R 基中也含有氨基。