1、专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【学习目标】研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。【学习重点与难点】1对土样的选取和选择培养基的配制。2对分解尿素的细菌的计数。【知识链接】尿素CO(NH2)2最初是从人的尿液中发现的，后来也是人工合成的第一个有机物，广泛存在于自然界中。尿素是一种有机态氮肥，经过土壤中细菌将尿素分解成氨之后才能被植物吸收利用。【新知预习】一、研究思路1筛选菌株尿素是一种重要的氮肥，农作物_直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为_和CO2，才能被植物利用，这是因为土壤中的这些细菌能合成_。因此，利用这一特点，可以将这些细菌从土壤中筛选出来。(
2、1)实验室中微生物的筛选的原理：人为提供有利于_生长的条件(包括营养、_、pH等)，同时_或_其他微生物生长。(2)选择培养基：在微生物学中，将允许_种类的微生物生长，同时_或_其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。2统计菌落数目常用来统计样品中活菌数目的方法是_。当样品的_足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中_。通过统计平板上的_，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在_的平板进行计数。这种方法统计的菌落数比活菌的实际数目_。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是_个菌落。因此，统计结果一般用_而不是活菌数来表示。除此之外，
3、_也是测定微生物数量的常用方法。另外，细菌的数目还可以通过_法来测定，例如，测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将_的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到_培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现_色，通过计数得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取_个水样。思考： 如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？3设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中_对实验结果的影响，提高实验结果的_。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养该种生物的_培养基作为空白对照。对照实验是指除了_的条件外，其他条件都_ _的实验。满足该条件的称为_组，未满足该条件的称为_组。二、实验设计实验设计的内容包括_、材料用具
4、、_和时间安排等。关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。应先铲去_3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的_中。2样品的稀释样品的_将直接影响平板上生长的菌落数目。由于不同微生物在土壤中_不同，因此，分离不同的微生物采用不同的_范围，其目的是保证获得菌落数在_之间、适于计数的平板。细菌稀释度为_，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为_。第一次实验时，可以将稀释的范围_一点，以保证能从中选择出适于计数的平板。3微生物的培养与观察培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在_C培养12 d，放线菌一般在2528 C培养57 d，
5、霉菌一般在_C的温度下培养34 d。在菌落计数时，每隔_h统计一次菌落数目。选取_时的记录作为结果，以防止因_不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在_的培养条件下(相同的_、温度及_)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。这些特征包括_、大小、_、颜色等方面。思考： 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？三、对分离得到的分解尿素的细菌的鉴定在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的_将尿素分解成了_。氨会使培养基的碱性_，pH_。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反 应是否发生。在以_为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH_，指示剂将变_，说明该细菌能够分解尿素
6、。思考：如果分离得到的分解尿素细菌的鉴定结果是脲酶阳性，则说明什么？【课堂探究】例1: “筛选”是分离和培养生物新类型常用的手段，下列有关技术中不能筛选成功的是( )A在全营养的培养基中，筛选大肠杆菌B在尿素固体培养基中，筛选能够分解尿素的微生物C用纤维素为唯一碳源的培养基，筛选能够分解纤维素的微生物D在培养基中加入不同浓度的氯化钠，筛选抗盐突变体植物例2:尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养尿素分解菌的培养基时( )A葡萄糖在培养基中含量越多越好 B尿素在培养基中含量适中最好C培养基中的尿素属于无机氮源 D尿素在培养基中越多越好类型一菌落数目的统计方法1稀释涂布平板法(又称_ _法)(1)
7、原理：当样品的_ _足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。(2)操作：第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。为使结果接近真实，需将同一浓度溶液涂布到3个或3个以上的平板中，培养后计数平均值。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在_ _的平板进行计数。若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。(3)计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。2显微镜直接计数法(1)原理：利用特定细菌计数
8、板或血细胞计数板，在_镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。 (2)操作：计数板是一特殊的载玻片，上面刻有面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室(或容积为2 mm2 mm0.1 mm的计数室)，在1 mm2的计数室内又被划成25(或16)个中格，每个中格又进一步划分成16(或25)个小格，计数室都由400个小格组成。将稀释后的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数45个中格的细菌数，并求出每小格所含细菌的平均数。 在直接计数中也需选择恰当的稀释度，也要求计数尽量准确，接近真实值，其方法：一是计数45个中格中菌体数求平均值；二是计数每个中格内菌体数目时，遵循“计上不计下，计左不计右
9、”的原则 。(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。两种计数方法相比较，稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活细菌数目低。原因是：一方面由于两个或多个细菌连在一起时，稀释涂布培养后只能观察到一个菌落；另一方面统计结果只是活细菌产生的菌落数，而未包括死细菌数目。例3:用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是 ( )A涂布了一个平板，统计的菌落数是230B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D涂布了三
10、个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233例4:下列有关菌落数目统计的说法中不正确的是 ( )A活菌计数法是测定微生物数量的唯一方法B当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌C为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数D统计的菌落数往往少于活菌的实际数目巩固练习：1用尿素作为唯一氮源的培养基筛选出来的微生物一定是所需要的微生物。( )2一般每克样品中的菌株数可用公式(CV)M计算，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积，M代表稀释倍数。 ( )3对照实验是指除了被测试的条件以外，其
11、他条件都相同的实验，其作用是比照实验，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。 ( )4成功统计菌落数目的关键是取计数值的平均值。 ( )5某微生物培养实验中应用两个牛肉膏蛋白胨培养基和一个选择培养基，一个牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目明显多于选择培养基上的数目，另一个牛肉膏蛋白胨培养基上没有菌落生长。 ( )课内达标1自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是 ( )A、碳源 B、氮源 C、无机盐 D、生长因子2发酵工程的第一个重要工作是选择优良的单一纯种。消灭杂菌，获得纯种的方法不包括（ ）A根据微生物对碳源需要的差别，使用含不同碳源的培养基B根据微生物缺
12、乏生长因子的种类，在培养基中增减不同的生长因子C根据微生物遗传组成的差异，在培养基中加入不同比例的核酸D根据微生物对抗菌素敏感性的差异，在培养基中加入不同的抗菌素3.利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是（ ）A酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌 B酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌 C酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳酸菌 D黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌4下列操作不属于微生物的分离步骤的是( )A稀释 B划线或涂布 C接斜面 D培养5影响微生物生长的主要环境因素是A阳光、温度、水分 B温度、水分、PH C水分、PH、氧 D温度、PH、氧6.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是（ ） A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹试剂D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
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