1、第 44 讲 植物的组织培养及植物有效成分的提取 1.植物的组织培养 2.从生物材料中提取某些特定的成分,学生用书 P301)一、植物组织培养1培养基(1)成分：大量元素、微量元素、有机成分、激素和琼脂。(2)类型：MS 培养基、发芽培养基和生根培养基。(3)作用：为植物组织或器官生长和发育提供营养条件。(4)制备：配制各种母液配制培养基灭菌。2组织培养(1)含义：在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。(2)原理：植物细胞具有全能性。(3)过程离体的植物组织、器官 脱分化 愈伤组织 再分
2、化根、芽 植物二、植物有效成分的提取1植物芳香油的提取(1)植物芳香油的主要化学成分：萜类化合物及其衍生物，具有很强的挥发性。提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。(2)提取玫瑰精油实验方法：水蒸气蒸馏法。实验流程鲜玫瑰花 加清水 水蒸气蒸馏 油水混合物 加入NaCl分离油层加入无水Na2SO4除水过滤玫瑰油(3)提取橘皮精油的实验方法：一般用压榨法实验流程：石灰水浸泡漂洗压榨 过滤静置再次过滤橘皮油2胡萝卜素的提取(1)胡萝卜素的性质：不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。(2)实验设计方法：萃取法，石油醚最适宜作萃取剂实验流程：胡萝卜粉碎干燥萃取 过滤浓缩胡萝卜素(3)鉴定方法：纸层析法。
3、1(2016江西南昌市统考)制备好的 MS 培养基用于植物组织培养时，需要加入植物激素。()2被子植物的花粉发育要经过小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。()3二倍体植株的花粉经脱分化与再分化后可得到稳定遗传的植株。()4培育草莓脱毒苗所采用的主要技术是组织培养。()5萃取是利用了芳香油易溶于有机溶剂的特性进行提取的一种方法。()6蒸馏法的实验原理是利用水将芳香油溶解下来，再把水蒸发掉，剩余的就是芳香油。()7水溶性和水不溶性有机溶剂都可以用于提取胡萝卜素。()8(2016南师大附中期末)影响萃取效率的因素除了萃取剂的性质和使用量之外，还有原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间
4、等。()考点一 植物的组织培养学生用书 P3011MS 培养基(植物组织培养用的培养基)的成分及各成分的作用成分作用微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压甘氨酸、维生素、烟酸、肌醇满足离体植物细胞在正常代谢途径受一定影响后所产生的特殊营养需求2.脱分化和再分化的比较过程特点条件脱分化外植体成为愈伤组织排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞团离体、营养物质、植物激素和其他适宜条件再分化愈伤组织成为丛芽或胚状体结构有根、芽或有生根、发芽的能力3.生长素和细胞分裂素在植物组织培养中的作用(1)有生长素存在，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势。(2)使用顺序不同，结果不同，见
5、下表：使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于细胞分裂，但细胞不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高(3)用量比值不同，结果也不同，见下表：生长素/细胞分裂素结果比值高时促进根的分化，抑制芽的形成比值低时促进芽的分化，抑制根的形成比值适中促进愈伤组织的形成4.菊花组织培养的过程菊花组织脱分化 形成愈伤组织再分化 长出丛芽生根移栽 菊花植株。5月季花药培养的两种途径以上两种途径之间没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素种类及其浓度配比。植物组织培养实验操作中的易错点(1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝；月季花药的培养实验中，应
6、选择花粉发育过程中的单核靠边期的花粉进行培养。(2)外植体消毒：所用消毒剂为体积分数为 70%的酒精和质量分数为 0.1%的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。(3)培养过程：在初期，菊花的组织培养需光照，月季花药的培养不需光照；而在后期均需光照。(4)月季花药培养得到的并不都是单倍体植株：花粉壁发育成二倍体，花药发育成单倍体。(5)花药开裂长出愈伤组织或释放出胚状体时，应及时转移到分化培养基上。(2016武汉调研)下面为一科研小组进行某外植体的植物组织培养实验的流程图解。外植体 a形成愈伤组织 b长出丛芽 c生根 d种苗请回答：(1)若进行菊花的组织培养，则一般选择未开花植株的茎上部_作为外
7、植体。本实验配制培养基一般需首先配制各种_，接种前培养基应经_处理。若进行月季花药的培养应选择_期的花粉。(2)脱分化主要发生在_(用字母表示)过程，再分化主要发生在_(用字母表示)过程。从植物组织到种苗形成的过程说明细胞具有_。(3)若在培养过程中，发现愈伤组织只分裂而不分化出芽和根，则可能原因有：细胞分裂素与生长素的比例_；激素使用顺序不当，先使用了_。(4)实验中常发现愈伤组织被真菌污染，为查找污染原因设计了四个实验，实验条件除图示外其他均相同，实验结果表示如图：据图可初步判断_是造成污染的最主要原因。解析：(1)未开花植株茎上新萌生的侧枝比较幼嫩，分裂能力强，容易诱导脱分化、再分化；配
8、制培养基时，要先配制培养基所需成分的母液，接种前要对培养基进行高压蒸汽灭菌处理。(2)由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程叫脱分化；脱分化产生的愈伤组织继续培养，又可以重新分化出根或芽等器官，叫再分化。(3)愈伤组织分化与否及产生根或芽，取决于生长素和细胞分裂素的浓度比值及使用的先后顺序，当细胞分裂素/生长素的比值低时，诱导根的分化；两者比值处于中间水平，愈伤组织只生长不分化；两者比值高时，诱导芽的形成。(4)随灭菌时间的推移、培养基 pH 的增大、温度的升高，污染率在一定范围内波动，而外植体消毒时间越长，污染率越低，说明污染主要是由外植体消毒时间短造成的。答案：(1)新萌生的侧枝(或
9、生长旺盛的嫩枝)母液 灭菌(高压蒸汽灭菌)单核靠边(2)a bc 全能性(3)适中 生长素(4)外植体消毒时间太短考点二 植物有效成分的提取学生用书 P3031植物有效成分提取的三种方法比较提取方法水蒸气蒸馏法压榨法萃取法实验原理利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发溶剂后就可获得芳香油方法步骤(1)水蒸气蒸馏；(2)分离油层；(3)除水过滤(1)石灰水浸泡、漂洗；(2)压榨、过滤静置；(3)再次过滤(1)粉碎、干燥；(2)萃取、过滤；(3)浓缩适用范围适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提
10、取适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中优点简单易行，便于分离生产成本低，易保持原料原有的结构和功能出油率高，易分离局限性水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题分离较为困难，出油率相对较低使用的有机溶剂处理不当会影响芳香油的质量2.增加植物有效成分提取量的关键措施(1)蒸馏法提取植物芳香油提取量主要取决于植物材料中芳香油的含量。由于植物芳香油易挥发，因此用水蒸气蒸馏法提取植物芳香油时应选择新鲜的植物材料(干燥后植物芳香油挥发)。(2)压榨法提取植物芳香油：植物材料中的果胶、果蜡会影响压榨和出油率，压榨前通常采用石灰水浸泡的方法除去果胶、果蜡，以提高出油率。(3)影响
11、胡萝卜素萃取的因素及解决措施影响因素解决措施萃取剂的性质用水不溶性有机溶剂原料的颗粒大小、紧密程度粉碎材料的含水量干燥萃取温度探索最佳萃取温度，严格控制温度萃取时间适当延长萃取时间胡萝卜素粗品鉴定过程中的 5 个易错点(1)层析时没有选择干净的滤纸，导致实验现象不明显。为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。(2)点样时点样圆点太大(直径大于 2 mm)，导致最终在滤纸上形成一条线，无法辨认被提取的色素。点样圆点的直径应为 2 mm。(3)将点好样的滤纸卷成筒状，卷纸时不能将滤纸两边相互接触，以避免由于毛细现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响
12、结果。(4)层析液没及样品原点，色素溶解于层析液中，造成实验失败。层析液不可没及样品原点，以免色素溶解于层析液中，使鉴定失败。(5)没有设置标准样品作对照。层析液中是否提取到胡萝卜素，可通过与标准样品中的-胡萝卜素作对比予以确认。(2016大连模拟)下面是与植物芳香油的提取有关的问题，请回答：(1)玫瑰精油的提取可使用图 1 所示装置，这种方法叫_蒸馏法。蒸馏时收集的蒸馏液_(填“是”或“不是”)纯的玫瑰精油。(2)胡萝卜素是_色的结晶。从胡萝卜中提取胡萝卜素常用的是_法，采用_加热。一般情况下，提取胡萝卜素时，提取效率与原料颗粒的含水量呈_相关。(3)经萃取、过滤得到的液体是_，之后还需利用
13、上述装置进行浓缩处理，该装置所起的作用是_。(4)图 2 为胡萝卜素的纸层析结果示意图，请据图回答：A、B、C、D 四点中，属于标准样品的样点是_。甲代表的物质是_，乙代表的物质是_。解析：(1)图 1 中装置为蒸馏装置，提取玫瑰精油可用水蒸气蒸馏法。蒸馏时，玫瑰精油和水蒸气一起蒸馏出来，经冷凝后得到的是油水混合物，不是纯的玫瑰精油。(2)胡萝卜素是橘黄色的结晶。提取胡萝卜素常用萃取法。由于有机溶剂易燃易爆，因此为了加快胡萝卜素的溶解，常采用水浴加热。提取效率与原料颗粒的含水量呈负相关。(3)萃取、过滤得到的液体是溶有胡萝卜素的萃取剂，由于胡萝卜素不易挥发，而萃取剂易挥发，因此可以利用蒸馏装置
14、蒸发掉萃取剂。(4)由于标准的胡萝卜素只有一种色素，而提取样品中会含有其他色素和杂质，根据层析的结果可知，A、C 扩散的结果只有一种色素，应为标准样品样点，而 B、D 层析的结果有两种物质，应为提取样品样点，其中与 A、C 层析结果相同的是物质甲，为胡萝卜素，乙为其他色素和杂质。答案：(1)水蒸气 不是(2)橘黄 萃取 水浴 负(3)溶有胡萝卜素的萃取剂 去除萃取剂(4)A 和 C 胡萝卜素 其他色素和杂质,学生用书 P304)1(2016唐山模拟)如图是植物组织培养过程示意图，请回答有关问题：外植体愈伤组织长出丛芽生根移栽成活(1)外植体若是菊花茎段组织，则在配制 MS 固体培养基时，_(填
15、“必需”或“不必”)添加植物激素。(2)外植体若是月季的花药，则图中的过程_(填“需要”或“不需要”)光照，而经过程培养出的植物一般称为_植株。该植株产生的途径除了图中所示外，还可以是花粉通过_阶段发育而来。(3)外植体若是菊花的根尖组织，则在正常环境下培养成的新菊花植株叶片的颜色是_，这一过程体现了植物细胞具有_。(4)植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂和分化的关键性激素，在植物组织培 养 过 程 中：若 先 使 用 细 胞 分 裂 素，后 使 用 生 长 素，实 验 结 果 是 细 胞_。当同时使用这两种激素时，生长素用量比细胞分裂素用量的比值_(填“高”“低”或“适中”)时，促进
16、愈伤组织的形成。解析：(1)由于菊花茎段的组织培养比较容易，因此在配制 MS 固体培养基时，不必添加植物激素。(2)图中的过程表示脱分化，月季花药培养的脱分化过程中不需要光照。通过花药离体培养获得的是单倍体植株。该植株产生的途径除了图中所示外，还可以是花粉通过胚状体阶段发育而来。(3)外植体若是菊花的根尖组织，由于植物细胞具有全能性，根尖细胞具有全套的遗传物质，则在正常环境下培养成的新菊花植株叶片的颜色是绿色。(4)植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势，分化频率高。在植物组织培养过程中，若先使用细胞分裂素，后使
17、用生长素，实验结果是细胞既分裂也分化。生长素用量与细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化，抑制根的形成；比例适中时，促进愈伤组织的生长。答案：(1)不必(2)不需要 单倍体(花粉)胚状体(3)绿色 全能性(4)既分裂也分化 适中2(2016湖南长沙二模)下图表示菊花的嫩枝和月季的花药离体培养过程，请据图回答下面的问题：(1)对菊花来说，要选取_的嫩枝来进行组织培养。对月季来说，适宜花粉培养的时期是_期。为确定花粉是否处于该时期，最常用的方法是_。(2)在 培 养 花 粉 的 培 养 基 中 要 加 入 一 定 的 植 物 激 素，常 用 的 植 物 激
18、 素 有_。(3)为了避免其他微生物对培养造成的影响，在进行接种时应注意_。接种室要消毒只要戴口罩，操作时便可说话外植体可预先用体积分数为 70%的酒精浸泡，取出用无菌水冲洗后，再用 0.1%的氯化汞溶液消毒，并用无菌水冲洗干净接种操作要在酒精灯火焰旁进行接种完毕应立即盖好瓶盖A BCD(4)月季的花药培养与菊花的嫩枝组织培养不同，从植株产生的途径来说，花粉植株产生的途径除了图中所示外，还可以通过_阶段发育而来，这两种发育途径的差别主要取决于_。(5)不同植物对各种条件的要求往往不同，进行菊花组织培养一般将温度控制在_，并且对光照的控制为_。解析：(1)植物组织培养法获取菊花植株时选用的材料一
19、般是生长旺盛的嫩枝。月季的花药培养中选择单核期的花药离体培养，成功率最高，确定花粉发育时期最常用的方法是醋酸洋红法。(2)在培养花粉的培养基中要加入细胞分裂素和生长素。(4)月季的花药培养与菊花的嫩枝组织培养不同，从植株产生的途径来说，花粉植株的产生一般有两种途径：一是花粉通过胚状体阶段发育为植株；另一种是花粉在诱导培养基上，先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种发育途径的差别主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。答案：(1)生长旺盛 单核 醋酸洋红法(2)细胞分裂素和生长素(3)C(4)胚状体 培养基中激素的种类及其浓度配比(5)1822 每天 12 小时光照3(2015高考全国卷
20、)回答与胡萝卜素有关的问题：(1)胡萝卜含有的胡萝卜素中，最主要的是_(填“胡萝卜素”“胡萝卜素”或“胡萝卜素”)，该胡萝卜素在人体内可以转变成两分子_，后者缺乏会引起人在弱光下视物不清的病症，该疾病称为_，胡萝卜素是_(填“挥发性”或“非挥发性”)物质。(2)工业生产上，用养殖的岩藻作为原料提取胡萝卜素时，_(填“需要”或“不需要”)将新鲜的岩藻干燥。(3)现有乙醇和乙酸乙酯两种溶剂，应选用其中的_作为胡萝卜素的萃取剂，不选用另外一种的理由是_。解析：(1)胡萝卜含有的胡萝卜素有三类，其中最主要的是胡萝卜素，胡萝卜素在人体内可以转变成维生素 A，维生素 A 缺乏会导致夜盲症。胡萝卜素是非挥发
21、性物质。(2)胡萝卜素的提取一般采用萃取法，萃取前需要对材料进行干燥处理，以提高萃取的效率。(3)萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有很高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶，如乙酸乙酯。乙醇是水溶性有机溶剂，因萃取过程中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它作萃取剂。答案：(1)胡萝卜素 维生素 A 夜盲症 非挥发性(2)需要(3)乙酸乙酯 萃取胡萝卜素的有机溶剂应不与水混溶，而乙醇为水溶性有机溶剂1(2016烟台诊断性测试)蓝莓提取物中的花青素不仅易于吸收，而且它们可以穿过血液脑屏障，保护各个精细组织的细胞，并能有效抑制破坏眼部细胞的酵素，从而改善视力。蓝莓中花青素获得途径如下图：(1)图
22、中和分别表示蓝莓组织培养中的_过程。如果要用此方法对蓝莓进行大规模繁殖，在对蓝莓外植体细胞进行接种前，需要进行_、_两项工作。(2)在外植体培养获得幼苗的过程中，除了需要提供一定的营养、_、温度、pH和光照外，还必须在_的条件下培养。培养基中的生长素和细胞分裂素用量的比值_(填“高”或“低”)时，有利于根的分化。(3)花青素易溶于甲醇、乙醇、丙酮等混合溶剂中，所以采用_法进行提取。新鲜的蓝莓含有大量的水分，在花青素的提取过程中，要对新鲜的蓝莓进行_处理，但要注意控制_和时间。答案：(1)脱分化(或去分化)、再分化 制备MS固体培养基(配制培养基)外植体消毒(两空可互换)(2)激素 无菌 高(3
23、)有机溶剂萃取 干燥(脱水)温度2(2016广东清远期末)传统药用植物栝楼的根、果实、种子等均能入药，其合成的天花粉蛋白是中药天花粉的主要有效成分。现科研人员进行以下的研究，大致流程如下：(1)接种在 MS 培养基中的栝楼种子，如先经加水浸没的萌发率为 75%，不加水浸没的萌发率为 2.5%，说明栝楼种子萌发需要_。(2)在培育“无菌苗”过程中，使用的部分激素组合如表 1(注：表示未添加该种植物激素)，除甲组仅有顶芽长成小苗外，所有的培养基上都有腋芽长出，可见诱导腋芽生长加入_是必需的。表 1组别6-BA(mg/L)NAA(mg/L)甲乙1.0丙0.5丁1.00.5戊2.00.5(3)在诱导“
24、愈伤组织”的 MS 培养基中，使用了以下一些激素组合(如表 2)，培养基上均能诱导叶盘缓慢长出黄绿色的愈伤组织，其中组 B2 和组 B3 诱导产生的愈伤组织在培养30 天后分化出小芽点，并迅速长大成无根苗，两组的分化率分别为 25.0%和 14.3%。可见0.2 mg/L NAA 与激动素(6BA 等)配合可诱导栝楼叶片_长出愈伤组织，但不利于诱导愈伤组织_。表 2组别NAA(mg/L)6-BA(mg/L)IAA(mg/L)KT(mg/L)A10.22.0B10.24.0C10.26.0A22.00.2B24.00.2C26.00.2A30.22.0B30.24.0C30.26.0 解析：(1
25、)从题意中可以看出，种子浸泡后萌发率提高，说明种子萌发过程中需要水分。(2)比较表格中信息和实验结果可以推测：只加入 6-BA 或 NAA 或 6-BA 和 NAA 二者均加入，都可以促进腋芽的生长。(3)A1、B1、C1 组中都是 0.2 mg/L NAA 与激动素(6-BA 等)配合，根据实验结果，只出现愈伤组织，说明 0.2 mg/L NAA 与激动素(6-BA 等)配合可以促进脱分化过程，由于没有长成幼苗，说明不利于再分化过程。答案：(1)充足的水分(水分、水)(2)6-BA 或 NAA 或 6-BA 和 NAA(植物激素)(3)脱分化 再分化3(2016太原八校一模)回答下列有关植物
26、有效成分提取的问题：(1)从胡萝卜中提取胡萝卜素时，通常在萃取前要将胡萝卜粉碎和_，以提高萃取效率。鉴定萃取物中是否含有胡萝卜素时，通常采用_法，在鉴定的过程中需要用_作为对照。(2)用 水 蒸 气 蒸 馏 法 提 取 薄 荷 油 时，在 油 水 混 合 物 中 加 入 氯 化 钠 的 作 用 是_，加入无水硫酸钠的作用是_，除去固体硫酸钠常用的方法是_。(3)橘皮精油的有效成分在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解，使用水中蒸馏法又会产生_的问题，所以一般采用_法。解析：(1)为提高萃取效率，从胡萝卜中提取胡萝卜素时，需要在萃取前将胡萝卜粉碎和干燥。通常采用纸层析法鉴定萃取物中是否含有胡萝卜素，在鉴
27、定的过程中需要用标准样品作为对照。(2)水蒸气蒸馏法提取薄荷油时，为使油层和水层分离，需在油水混合物中加入氯化钠；分离出的油层中加入无水硫酸钠的作用是除去少量的水，除去固体硫酸钠的常用方法是过滤。(3)由于橘皮精油的有效成分在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解，使用水中蒸馏法又会产生原料焦糊的问题，所以一般采用压榨法提取橘皮精油。答案：(1)干燥 纸层析 标准样品(2)有利于油层和水层的分离 除去少量的水 过滤(3)原料焦糊 压榨4胡萝卜素是一种常用的食用色素，可分别从胡萝卜或产胡萝卜素的微生物菌体中提取获得，流程如下：酵母菌 R,的筛选)酵母菌 R,的培养)菌体,裂解)离心),sdo5(沉淀)胡萝
28、卜粉碎干燥萃取过滤浓缩胡萝卜素的鉴定(1)筛选产胡萝卜素的酵母菌 R 时，可选用_或平板划线法接种。采用平板划线法接种时需先灼烧接种环，其目的是_。(2)培养酵母菌 R 时，培养基中的蔗糖和硝酸盐可分别为酵母菌 R 的生长提供_和_。(3)从胡萝卜中提取胡萝卜素时，干燥过程应控制好温度和_以防止胡萝卜素分解；萃取过程中宜采用_方式加热以防止温度过高；萃取液浓缩前需进行过滤，其目的是_。(4)纸层析法可用于鉴定所提取的胡萝卜素。鉴定过程中需用胡萝卜素标准品作为_。解析：(1)接种微生物的方法主要是稀释涂布平板法和平板划线法。接种过程中为了避免杂菌的污染，要进行无菌操作，必须对接种环进行灼烧处理。
29、(2)在微生物培养过程中，蔗糖主要提供碳源，也可以作为能源物质；硝酸盐中含有氮元素，可提供氮源。(3)提取胡萝卜素时，温度过高、时间过长会导致胡萝卜素分解；由于萃取剂通常具有挥发性，直接加热时挥发出来的有机溶剂遇明火易爆炸，故常采用水浴加热；萃取和浓缩前进行过滤是为了将原料中的不溶物滤去。(4)提取出来的胡萝卜素往往不纯，鉴定时常用标准品作为对照。答案：(1)稀释涂布平板法(或稀释混合平板法)灭菌(或防止杂菌污染)(2)碳源 氮源(3)时间 水浴 滤去不溶物(4)(实验)对照5(2016长春二模)研究发现柚皮精油和乳酸菌素(蛋白质)均有抑菌作用，两者的提取及应用如图所示。据图回答下列问题：(1
30、)为了提高出油率，也因为柚皮易焦糊，宜采用_法提取柚皮精油，该过程得到的糊状液体可通过_除去其中的固体杂质。(2)为了分离出优良的乳酸菌 A，需要制备_培养基；若需长期保存菌种，可采取的方法是_。(3)抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈。可通过测定透明圈的_来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。(4)某橘农发现自家一橘树具有抗虫性状，欲利用组织培养技术大量繁殖。若用花药离体培养，则应选择_期的花药成功率最高。确定花粉发育期最常用的方法是_法，若花粉不易着色，需采用_法。通过花药培养产生花粉植株一般有两种途径：一是花粉通过_阶段发育为植株；另一种是花粉在_培养基上，先
31、形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。解析：(1)为了提高出油率，也因为柚皮易焦糊，所以一般采用压榨法提取柚皮精油，过滤压榨获得的糊状液体，即可得到柚皮精油。(2)一般选用选择培养基分离获得优良的乳酸菌；宜采用甘油管藏法长期储存菌种。(3)抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈，通过测定透明圈的直径大小来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。(4)选择单核期的花药离体培养，成功率最高。确定花粉发育期最常用的方法是醋酸洋红法，若花粉不易着色，需采用焙花青铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。通过花药培养产生花粉植株一般有两种途径：一种是花粉通过胚状体阶段发育为植株；另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。答案：(1)压榨 过滤(2)选择 甘油管藏(3)直径(或半径、大小、面积等合理答案)(4)单核(单核靠边)醋酸洋红 焙花青铬矾 胚状体 诱导