1、课题3 血红蛋白的提取和分离 思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。一、基础知识：凝胶色谱法（分配色谱法）：2、凝胶：一些微小的多孔球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）1、概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法 当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的
2、通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快3、原理：4、具体过程 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个 能够抵制（)对溶液的（）的影响，维持PH 基本不变。缓冲溶液：1、作用：外界的酸或碱 PH值 2、缓冲溶液的配制 通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。12 使用比例 在不同PH范围内 3.为什么在本实验中实用缓冲溶液?在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功
3、能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）思考：人体血液中缓冲液?NaH2PO4/Na2HPO4 H2CO3/NaHCO3（三）电泳：1.概念：带电离子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。测定（）通常用 SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质相对分子质量使用S
4、DS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异 二 实验操作-蛋白质的提取和分离：样品处理粗分离纯化纯度鉴定 蛋白质的提取和分离：（1）样品处理洗涤红细胞血红蛋白释放分离血红蛋白溶液。（2）粗分离（透析）目的步骤a过程：b目的：c原理：除去样品中分子量较小的杂质 透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。(3)纯化：（4）纯度鉴定：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。血液 血浆 水分 其他：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞（最多）血红蛋白（
5、90）两个肽链 两个一肽链 四个亚铁红素基团 2.你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好用哪种血液来提取血红蛋白？为什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取。人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。分离血红蛋白溶液有机溶剂 （无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液 （红色透明液体）红细胞破碎物沉（暗红色沉淀物）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是_。血红蛋白有什么特点？_。这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去 血红蛋白呈现红
6、色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。下列操作正确的是（）A.分离红细胞时采用低速长时间离心 B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h D下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是 ()多 A采集血样后要高速短时问离心获得血细胞 B洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白 D释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分
7、离开来 BCD在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是 A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果 C洗涤过程选用0.1%的生理盐水 D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 D 凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为16 cm，有关说法中，正确的是 多 A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果 B凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果 C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度 D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大 样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 A