1、第35讲克隆技术浙江学考选考考纲确认考点知识内容加试二、克隆技术5.植物的克隆b6.动物的克隆a考点一| 植物的克隆技术1植物细胞的全能性和组织培养方法(1)植物组织培养的原理：植物细胞具有全能性，即植物体的每个生活细胞都具有发育成完整植株的潜能。(2)植物组织培养程序：配制培养基：配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的半固体培养基。切取外植体：从消毒的根、茎、叶上切取一些小组织块。获得愈伤组织：将组织块置于半固体培养基中培养，切口处细胞在创伤的刺激下发生脱分化，在创口表面形成一种由相对未分化的薄壁细胞团组成的新组织。再生新植株：以适当配比的营养物质和植物生长调节剂诱导愈伤组织，直到再生出新植
2、株。将含有愈伤组织的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养，可以分散成单细胞(胚性细胞：细胞质丰富、液泡小、核大)，这种单细胞可发育成胚状体，再继续发育可以形成植株。2植物细胞的全能性体现(1)相对于动物细胞，植物细胞的全能性更容易(填“难”或“容易”)体现。(2)不同种类的植物或同种植物的不同基因型个体的细胞全能性表达程度不同。(3)在长期培养中，培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因：染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生；细胞或组织中的激素平衡被打破；细胞对外源生长物质的敏感性发生改变等。3细胞培养和器官培养器官发生和形态建成主要是通过平衡植物激素配比进行调控：适量的生长素和细胞分裂素配比
3、，可诱导芽的分化；适量的吲哚乙酸及适当减除某些其他激素，可诱导生根。4原生质体培养和植物细胞工程(1)原生质体的培养制备原生质体的原因：植物细胞壁的存在，使植物组织培养与克隆有一定难度。制备原生质体的方法：在0.50.6 mol/L的甘露醇溶液环境下，用纤维素酶和果胶酶混合液处理。(2)植物细胞工程：1植物组织培养关键过程总结名称过程形成体特点培养基光脱分化由外植体脱分化为愈伤组织排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞团生长素与细胞分裂素的比例大避光再分化由愈伤组织分化为幼苗或胚状结构有根、芽或有生根发芽的能力生长素与细胞分裂素的比例小需光营养生长和生殖生长发育成完整的植物体由根、茎、叶、花、果实、种
4、子组成自身产生各种激素需光2.植物组织培养基本操作要求(1)取材：含形成层(分生组织)的部分易于诱导形成愈伤组织。尽管植物体其他已分化的部分也可以用于组织培养，但诱导形成愈伤组织比较困难。(2)消毒：培养基中含有丰富的营养物质，不仅有利于培养物的生长，也利于各种杂菌的生长。一旦污染，迅速生长的各种杂菌不仅会与培养物争夺营养，而且杂菌会产生大量对培养物有害的物质，导致培养物死亡。1(20161月宁波期末测试)下图表示通过克隆技术获得烟草植株的过程，请回答下列问题：(1)过程往往选取烟草叶片的幼嫩部位，需经过_处理，才能置于培养基中培养。(2)过程称为_，过程称为_。(3)通过悬浮培养形成的单细胞
5、可发育成_，继而形成植物幼体；也可利用_水解细胞壁，获得_，其经培养后也可形成完整植株。(4)在培养过程中，若要诱导芽的产生，则配制植物激素时要_。A添加适量的生长素和适当减除某些其他激素B添加适当配比的生长素和细胞分裂素C添加适量的生长素和适当增加某些其他激素D适当增加细胞分裂素和生长素的量(5)烟草细胞很容易再生出新植株，但在长期培养过程中，其胚胎发生和器官形成能力下降，其原因不可能是_。A染色体畸变或细胞核变异B组织或细胞中的激素平衡被打破C产生了缺乏成胚性的细胞系D植物细胞全能性丧失【解析】(1)自然环境中获取的植物组织、器官携带较多微生物，会影响培养过程中植物细胞的生长，因此需先进行
6、消毒处理。(2)高度分化的植物细胞经培养形成相对未分化的愈伤组织细胞，此过程称为脱分化；而相对未分化的愈伤组织细胞经诱导分化成胚的过程，称为再分化。(3)据图可知，悬浮培养的单细胞可发育成幼胚；细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，因此可使用纤维素酶和果胶酶处理细胞壁；植物细胞壁去除后内部的结构称为原生质体。(4)营养物质和植物生长调节剂配比会影响愈伤组织的分化方向，例如适量的生长素和细胞分裂素配比可以诱导芽的分化，适量的生长素和适当减除某些其他激素则可以诱导生根，故要诱导芽的产生，应按照B选项操作。(5)在长期培养中，培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的原因可能有：染色体畸变、细胞核变异或非整倍体
7、产生、细胞或组织中的激素平衡被打破、细胞对外源生长物质的敏感性发生改变等，以及随着时间推移，由于其他各种原因产生了缺乏成胚性的细胞系，故A、B、C选项正确；植物细胞仍保留了该物种全套的遗传物质，故全能性并未丧失，但由于各种原因，其全能性的表达受到了阻碍，D选项错误。【答案】(1)消毒(2)脱分化再分化(3)幼胚(或胚状体)纤维素酶和果胶酶原生质体(4)B(5)D2(20163月嘉兴模拟卷)利用生物工程培育抗虫植物的过程如下图所示，请回答下列问题：甲乙丙丁戊(1)图中基因工程的载体是_，目的基因是_。甲乙过程需要的工具酶是_。(2)基因工程的核心是_。A乙的构建B丙的形成C丁的筛选D戊的培育(3
8、)丁戊过程说明植物细胞具有_。在这个过程中，丁细胞在特定的刺激下发生_成为具有分裂能力的细胞，并且不断地分裂增殖形成愈伤组织。通过调节营养物质和植物生长调节剂的配比，从愈伤组织中诱导出_，并由此再生出植株。(4)丁戊过程中形成愈伤组织，可通过液体悬浮培养分散成单细胞。下列特征中，这种细胞不具有的是_。A细胞质丰富B液泡大C可发育成胚状体D细胞核大【解析】(1)图中将Ti质粒与含抗虫基因的DNA拼接成重组Ti质粒进行转基因操作获得抗虫植株，说明目的基因为抗虫基因，而载体为Ti质粒；将二者拼接之前需先用限制性核酸内切酶切出相应的粘性末端，然后用DNA连接酶进行拼接。(2)基因工程的核心是构建重组D
9、NA分子，即形成乙的过程。(3)细胞的全能性指已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能，丁戊的过程是植物细胞发育成完整植株的过程，体现了植物细胞的全能性；丁细胞为高度分化的细胞，脱分化形成的愈伤组织细胞为相对未分化的细胞，具较强的分裂能力；调节营养物质和植物生长调节剂配比会影响愈伤组织的分化方向，例如适量的生长素和细胞分裂素配比可以诱导芽的分化，适量的生长素和适当减除某些其他激素则可以诱导生根。(4)愈伤组织液体悬浮培养会形成细胞质丰富、液泡小而核大的胚性细胞，经进一步培育可形成胚状体，故A、C、D项正确，而B项错误。【答案】(1)Ti质粒(甲)抗虫基因限制性核酸内切酶和DNA连接酶(2)A
10、(3)(遗传的)全能性脱分化芽和根(芽和根的顶端分生组织)(4)B考点二| 动物的克隆技术1动物细胞培养和克隆化培养(1)动物克隆的技术基础是动物的细胞和组织培养。(2)动物细胞培养：将动物体内部分组织取出，经过机械消化或胰蛋白酶消化，使其分散成单个细胞；然后在人工控制条件下，使这些细胞得以生存，并保持生长、分裂乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡等生命现象。(3)动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。动物组织培养过程中可以伴随组织分化。(4)原代培养与传代培养：原代培养：即从机体中取出后立即进行的细胞和组织培养。传代培养：即将原代培养的细胞分成若干份，接种到若干份培养基
11、中，使其继续生长、增殖。(5)细胞系与细胞株：细胞系：指可连续传代的细胞，包括连续细胞系和有限细胞系。细胞株：通过一定的选择和纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞，包括连续细胞株和有限细胞株。一般具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和生化特性。(6)克隆化培养法：概念：把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。最基本要求：必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。提高克隆成功率的措施：选择适宜的培养基、添加血清、以滋养细胞支持生长、激素刺激，使用CO2培养箱调节pH。2动物的细胞融合技术及其应用(1)方法：植物原生质体可以融合，动物细胞在一定
12、物质(如灭活的仙台病毒、聚乙二醇)介导下或电刺激下相互融合。(2)应用实例：杂交瘤技术制备单克隆抗体杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本方法：用外界抗原刺激动物，使其发生免疫反应，B淋巴细胞产生抗体；将经免疫的动物的B淋巴细胞和可无限传代的骨髓瘤细胞融合，经过筛选、克隆化培养，获得既能产生特异性抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞。单克隆抗体的特点：纯度高、特异性强。3动物的克隆繁殖(1)动物细胞全能性的表现程度：受精卵多能细胞单能细胞高度分化细胞。(2)动物难以克隆的根本原因：个体发育过程中，细胞分化使得细胞发生了基因的差异表达，体细胞的基因组中基因活动很不完全，不能像受精卵那样发挥全能性。(3)细胞核
13、移植实验与动物的克隆繁殖：核移植：利用一个细胞的细胞核取代另一个细胞的细胞核，形成一个重建的合子。动物克隆繁殖的一般过程：克隆动物获得成功的部分原因：重组卵细胞最初分裂时虽然复制了DNA，但基因的转录并未开始；同时，供体核DNA开始丢失来源于供核细胞的调节蛋白，在重组卵细胞开始第三次分裂时，这些调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因，进而调控胚在代孕母体子宫中的进一步发育。1克隆与核移植(1)原理：动物体细胞核具有全能性。(2)过程：(3)结果：产生新个体。2单克隆抗体的制备(1)原理：一个(或一种)浆细胞(效应B细胞、B淋巴细胞)只产生一
14、种抗体，小鼠骨髓瘤细胞能够无限增殖。因此杂交瘤细胞就具备了既能无限增殖，又能大量产生单一抗体的特征。(2)杂交瘤技术制备单抗的基本方法用外界抗原刺激动物(如小鼠、兔子等)，使其发生免疫反应，使B淋巴细胞产生抗体；利用仙台病毒或聚乙二醇等作介导，使经免疫的动物的脾细胞与可以无限传代的骨髓瘤细胞融合；经过筛选、克隆培养，获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞克隆。(3)过程杂交瘤细胞杂交瘤细胞单克隆抗体(4)杂交瘤技术制备单抗的优点可以从特异抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗。这是因为，经过克隆筛选，可以从产生各种不同抗体的杂交瘤混合群体中得到产生特异抗体的杂交瘤。(5)
15、单克隆抗体的应用单克隆抗体可作为特异探针，研究相应抗原蛋白的结构、细胞分布及其功能。1下图为动物细胞培养的基本过程示意图，回答下列问题：ABCD(1)容器A中放入的一般是幼龄动物的器官或组织，原因是其细胞_、易于培养。培养时先要剪碎，然后用_分散细胞，制成B瓶中的细胞悬液。将细胞悬液转入C瓶中进行的初次培养称为_。(2)在D瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞绝大部分死亡，只有极少数细胞存活并可无限增殖，这样的细胞系被称为_，它们大多数具有_核型。(3)为保证无菌、无毒的环境，B、C、D瓶中的培养基中需要添加一定量的_；还需要提供O2和CO2等气体环境，CO2的作用主要是_。(4)动物细胞体外培
16、养时，通常要在培养基中补充一定浓度的某些物质。下图表示血清对正常细胞和癌细胞培养影响的实验结果。据图可知，培养_细胞一定需要添加血清。【解析】(1)动物细胞培养是利用细胞增殖能力以获取大量动物细胞的技术。幼龄动物的器官或组织中的细胞分裂能力强，适宜培养；胰蛋白酶处理可去除细胞粘连蛋白，使细胞分散开来；从机体中取出的细胞经分散处理后立即进行的培养称为原代培养。(2)能够连续培养下去的细胞系称为连续细胞系，题中明确说明这些细胞可无限增殖，故属于连续细胞系；连续细胞系被认为是发生了转化的细胞系，大多具有异倍体核型。(3)加入一定量的抗生素可杀灭病菌，防止对动物细胞的生长增殖造成影响；CO2的作用主要
17、是维持动物细胞正常生长所需的pH。(4)据图中实验结果可知，是否添加血清对癌细胞的数量影响不大，但明显影响正常细胞的数量，故正常细胞培养过程一定要添加血清。【答案】(1)分裂能力强胰蛋白酶原代培养(2)连续细胞系异倍体(3)抗生素维持培养液的pH(4)正常2小鼠胚胎干细胞培养、皮肤细胞诱导出多种细胞及制备单克隆抗体的操作流程如下。请回答：(1)操作流程中过程可用_处理获得一个胚胎干细胞；过程中的细胞_(填“可能”或“不可能”)出现接触抑制现象；过程中细胞内核酸的种类_(填“不变”或“改变”)；过程的核心步骤是_。(2)过程常用的促融剂是_(要求写出2种)。单克隆抗体的制备过程中，运用了动物克隆
18、技术中的_两大技术。(3)下列关于单克隆抗体制备过程的叙述，正确的是_。A传代培养效应B细胞是单克隆抗体制备的必要操作之一B丙细胞能够无限增殖，实质上就是癌变的效应B细胞C经选择培养基筛选出来的丙细胞即可用于单克隆抗体的生产D操作流程中过程的原理和植物原生质体融合的原理基本相同【解析】(1)胰蛋白酶可使细胞间的粘连蛋白水解，使细胞彼此分散开来，获得单细胞；只有恶性细胞系(癌细胞)的表面粘连蛋白减少或缺失，失去接触抑制，胚胎干细胞属非恶性细胞，保留接触抑制；过程为细胞分化，实质是基因的差异性表达，虽然遗传物质并未改变，但基因表达过程中产生的mRNA种类和数量发生了变化；基因工程的核心是构建重组D
19、NA分子。(2)动物细胞融合常用灭活的仙台病毒或聚乙二醇促融；制备单克隆抗体需将经免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤细胞，然后对杂交瘤细胞培养，使其增殖并产生特异性抗体，故需运用动物细胞融合和动物细胞培养两大技术。(3)效应B细胞无增殖能力，无法传代培养，A选项错误；丙是经免疫的B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，并非癌变的效应B细胞，B选项错误；选择培养基只是将杂交瘤细胞筛选出来，但该杂交瘤细胞是否能产生特异性抗体，还需将该杂交瘤细胞单独培养并利用抗原抗体杂交反应进行进一步筛选，C选项错误；流程与植物原生质体融合都利用了细胞膜的流动性，D选项正确。【答案】(1)胰蛋白酶可能改变构建重组DNA分子(2)聚乙二醇、灭活的仙台病毒动物细胞融合和动物细胞培养(3)D