1、DNA片段的扩增及电泳鉴定基因工程 Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsDNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragments实验原理（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理：（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。一次PCR一般要经历30次循环。1.了解
2、PCR和电泳鉴定的基本原理2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物DNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragments2.DNA片段电泳鉴定的原理：（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关。（3）凝胶中的DNA分子通过染
3、色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。DNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsDNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragments材料用具 1.试剂：（1）无菌水、琼脂糖；（2）电泳缓冲液（TAE或TBE）；（3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂溴酚蓝）；（4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。DNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and elect
4、rophoresis identification of DNA fragments材料用具 2.用具：（1）PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）（2）微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）（3）微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）（4）一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）（5）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）电泳装置DNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragments推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 微量离心管 PCR仪注意：加不同
5、样品时，需要更换枪头 DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的扩增Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsAmplification of DNA fragments用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。1.PCR加样材料用量10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5L20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP）1L20mol/L的引物2.5L20mol/L的引物2.5LH2O2833L1-5U/L的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）
6、12U模板DNA（用量为1pg-1g）510L方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的扩增Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsAmplification of DNA fragments待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。2.离心3.扩增将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的扩增Amplification and electrophoresis identification o
7、f DNA fragmentsAmplification of DNA fragments循环程序变性复性延伸预变性94，5min30次94，30s55，30s72，1min最后1次94，1min55，30s72，1min3.扩增参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。可根据目的片段长度适当调整延伸时间预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。DNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsDNA片段的扩增加样用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量
8、离心管中依次加入各组分离心待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）扩增参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsElectrophoresis identification of DNA fragments根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2
9、%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。4.配制琼脂糖溶液方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsElectrophoresis identification of DNA fragments凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。5.制备凝胶将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。加样孔侧连电极负极。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。电泳缓
10、冲液用来维持PH值，使DNA带负电荷。DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsElectrophoresis identification of DNA fragments将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。6.电泳加样凝胶载样缓冲液类似层析液 7.电泳、观察接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。待指示
11、剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。DNA片段的扩增及电泳鉴定Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsDNA片段的电泳鉴定配制琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀制备凝胶将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没
12、过凝胶1mm为宜加样将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物电泳接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为15V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳观察记录取出凝胶置于紫外灯下观察和照相DNA片段的扩增及电泳鉴定注意事项Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsMatters needing attention1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头
13、和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。DNA片段的扩增及电泳鉴定结果分析与评价Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsResults analysis and evaluation1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是
14、什么？可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。DNA片段的扩增及电泳鉴定结果分析与评价Amplification and electrophoresis identification of DNA fragmentsResults analysis and evaluation如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。课时作业