1、1.2 基因工程的基本操作程序概念认知自主学习一、目的基因的获取1.目的基因:(1)主要指_的基因。(2)也可以是具有_的因子。编码蛋白质调控作用2.获取目的基因的三种常用方法:(1)从基因文库中获取。基因文库的含义:将含有_不同基因的许多_,导入_的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因文库的类型。a.基因组文库:包含了一种生物_的基因。b.部分基因文库:只包含了一种生物的_基因,如cDNA文库。获取目的基因的依据:目的基因的有关信息。某种生物DNA片段受体菌所有一部分(2)利用PCR技术扩增。含义:PCR是_的缩写。它是一项在生物体外_的核酸合成技术。原理:
2、_。多聚酶链式反应复制特定DNA片段DNA双链复制条件。a.引物:根据已知目的基因的核苷酸序列合成的。b.DNA模板:其上有_。c.Taq酶:_。d.原料:_。e.能量:提供热能(解旋),另外,子链延伸形成新的磷酸二酯键需要高能磷酸键水解释放的化学能。目的基因热稳定DNA聚合酶4种脱氧核苷酸PCR扩增过程:过程说明图解变性当温度上升到9095 时,双链DNA解旋为_复性冷却至5560,两种引物通过_与两条单链相应互补序列结合延伸加热至7075,_酶催化DNA新链由5 端向3 端延伸单链碱基互补配对Taq场所:细胞外(如PCR扩增仪)。结果:以指数方式扩增(约为2n,n为扩增循环的次数)。(3)
3、人工合成法。条件:基因比较小,_已知。方法:通过_用化学方法直接人工合成。核苷酸序列DNA合成仪二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的:(1)使目的基因在_中稳定存在,并且可以_给下一代。(2)使目的基因能够_和_。2.基因表达载体的组成:3.基因表达载体的功能:通过基因表达载体将_导入受体细胞。受体细胞遗传表达发挥作用目的基因三、将目的基因导入受体细胞1.转化含义:_进入受体细胞内,并且在受体细胞内_和_的过程。2.转化方法:导入细胞类型方法受体植物细胞_、基因枪法、花粉管通道法受精卵或体细胞动物细胞_微生物细胞_处理法原核生物目的基因维持稳定表达农杆菌转化法显微注射技术受精卵Ca
4、2+四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平检测:(连线)2.个体生物学水平的鉴定:抗虫或抗病的接种实验,产品功能活性比较等。【易错辨析】1.所有的目的基因都可以从cDNA文库中获取。()【分析】基因文库包括部分基因文库(如cDNA文库)和基因组文库,前者含有某生物的部分基因,不可能从其中获得全部目的基因,后者包含该生物的所有基因,可以获取所有目的基因。2.如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同,则这两个基因的结构也完全相同。()【分析】cDNA文库中的DNA来源于mRNA的反转录过程,所以该DNA(或基因)与该生物基因组文库中的基因在结构上是有区别的
5、,如不含内含子等。3.Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。()【分析】Taq酶是热稳定DNA聚合酶,是连接单个脱氧核苷酸的,不是DNA连接酶。4.用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。()5.基因表达载体中含有启动子和密码子。()【分析】基因表达载体的构建是基因工程的核心,基因表达载体包括启动子、终止子、标记基因和目的基因。密码子是位于信使RNA上的相邻的三个碱基。6.水稻植株受到损伤时,伤口处细胞会分泌酚类化合物,吸引农杆菌,引起植株感染。()【分析】农杆菌主要感染双子叶植物和裸子植物,而水稻是单子叶植物。7.农杆菌感染植物的机理:Ti质粒上
6、的T-DNA可转移到植物受体细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起。()8.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。()9.目的基因的检测和鉴定过程中,分子水平的检测方法都是DNA分子杂交技术。()【分析】检测是否转录出mRNA利用的是分子杂交技术(是DNA探针与mRNA的杂交),检测是否翻译出相应的蛋白质,利用的是抗原抗体杂交技术。10.基因工程的四个步骤中都涉及碱基互补配对原则。()【分析】第三步“将目的基因导入受体细胞”中没有涉及碱基互补配对原则。能力形成合作探究一、获取目的基因及基因表达载体的构建1.获取目的基因的方法比较:(1)过程比较。基因组文库:cDNA文库:PC
7、R技术:人工合成:(2)四种方法的比较:方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)优点操作简单专一性可在短时间内大量扩增目的基因专一性强,可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较烦琐,技术要求过高需要严格控制温度,技术要求高适用范围小2.基因表达载体的构建方法:(2)构建方法:【易错提醒】(1)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位,若目的基因插入到启动子内部,启动子将失去原功能。(2)混淆启动子与起始密码子,终止子与终止密码子:启动子:一段有特殊结构的DN
8、A片段,其位于基因的首端它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子:一段有特殊结构的DNA短片段,其位于基因的尾端其作用是使转录过程停止。起始密码子和终止密码子位于mRNA上,二者分别控制翻译过程的启动和终止。(3)切割目的基因与切割载体时不一定“只能”使用“同一种酶”在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶,以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”,可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体,使目的基因两侧及载体切口两侧均具有两个不同的黏性末端,但又能彼此嵌入
9、。【选修对接必修】对接必修2:基因的表达(1)基因是有遗传效应的_片段。DNA分子上分布着多个基因,基因在染色体上呈_排列。(2)起始密码子和终止密码子位于_上,分别控制翻译过程的启动和终止。启动子是一段特殊结构的_片段,位于基因的首端,驱动基因的转录。DNA线性mRNADNA【素养案例】为增加菊花的花色类型,研究者从其他植物的cDNA文库中提取出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花细胞中。图3表示EcoR、BamH 和Sau3A 三种限制酶的识别序列与切割位点。请分析回答:(1)利用PCR技术扩增目的基因C的原理是_。(2)图2所示质粒被_切割获得的产物可与图1
10、所示基因C连接,理由是_。(3)经BamH处理后构建的重组质粒导入菊花细胞后,基因C不能表达,原因是质粒酶切部位的两端无_,导致基因C不能_。(4)在添加四环素的固体培养基上,_(填“能”或“不能”)筛选出含有插入基因C的重组质粒的农杆菌单菌落,原因是_。【解析】(1)利用PCR技术扩增目的基因C的原理是DNA双链复制。(2)据图3可知,由于BamH和Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端,因此图2所示质粒被BamH和Sau3A切割获得的产物可与图1所示基因C连接。(3)据图可知,经BamH处理后构建的重组质粒导入菊花细胞后,基因C不能表达,原因是质粒酶切部位的两端无启动子和终止子
11、,导致基因C不能转录。(4)由于含质粒的农杆菌和含重组质粒的农杆菌均含有抗四环素基因,在含四环素的培养基上均能生长,所以在添加四环素的固体培养基上,不能筛选出含有插入基因C的重组质粒的农杆菌单菌落。答案:(1)DNA双链复制(2)BamH和Sau3A 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(3)启动子和终止子 转录(4)不能 含质粒的农杆菌和含重组质粒的农杆菌均含有抗四环素基因,在含四环素的培养基上均能生长【跟踪训练】1.下列关于基因文库的说法中,不正确的是()A.某果蝇X染色体上的所有基因组成的文库是部分基因文库B.cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流C.取出果蝇某细胞中全部mRN
12、A,通过反转录产生的全部DNA片段称为该果蝇的基因组文库D.从cDNA文库中获取的目的基因,既无启动子,又无终止子【解析】选C。某果蝇X染色体上的所有基因组成的文库是部分基因文库,A项正确;cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流,B项正确;取出果蝇某细胞中全部mRNA,通过反转录产生的全部DNA片段称为部分基因文库,C项错误。cDNA文库是用mRNA反转录得到的DNA,只含有编码对应蛋白质的信息,没有控制该基因表达的相关元件(启动子、终止子),也没有内含子,因此从cDNA文库中获取的目的基因没有启动子和终止子,D项正确。2.(2018全国卷节选)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下
13、会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题:(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是_。使用这两种酶进行酶切是为了保证_,也是为了保证_。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了_和_过程。(3)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同
14、学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。【解析】(1)将甲插入质粒P0时,为了保证甲(L1-GFP融合基因)的完整性,应该选择E1和E4两种酶切割,并且把目的基因插入启动子和终止子之间,从而使其能在受体细胞中表达。(2)在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光表明基因已表达,而基因的表达包括转录和翻译两个过程。(3)检测甲是否存在于牛的不同组织细胞中,可以采用PCR技术扩增,再用DNA分子杂交技术来检测,PCR技术中模板是DNA,并不是RNA。答案:(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接(2)转录 翻译(3)核DNA
15、二、目的基因导入受体细胞及检测与鉴定1.将目的基因导入受体细胞的“三种类型”:(1)导入植物细胞农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法。受体细胞:体细胞或受精卵。原理:农杆菌在自然条件下易感染双子叶植物和裸子植物,并将其Ti质粒上的T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。(2)导入动物细胞显微注射法,其受体细胞为受精卵。(3)导入微生物细胞感受态细胞法,需用Ca2+处理,获得感受态细胞使其能吸收DNA分子。2.目的基因检测与鉴定的“两个水平”:【易错提醒】关于不同分子检测的原理、场所、探针的异同(1)原理:转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的,只是被检测的物质不再是转基因生物的基
16、因组DNA,而是mRNA;翻译水平的检测,则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。(2)场所:不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测,都是在体外进行的。(3)探针:在DNA分子、mRNA分子水平上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时,用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。【选修对接必修】对接必修2:基因的表达在新型冠状病毒肆虐全球时,针对该病毒的核酸检测试剂盒发挥了重要作用。已知试剂盒中有:逆转录酶试剂、病毒核酸标准试剂、Taq酶、游离的脱氧核糖核苷酸、引物、特异性的荧光探针、缓冲试剂等。请根据此信息回答下列问题:(1)检测过程中为什么需要逆转录酶?提示:新型冠状病毒的
17、遗传物质是RNA,而检测时用的探针为荧光标记的DNA片段,需要以RNA为模板通过逆转录合成DNA,因此需要逆转录酶。(2)荧光探针的作用是什么?它是用什么制成的?提示:作用:荧光探针通过分子杂交与新型冠状病毒的RNA结合,产生杂交带,从而快速检测体内是否存在新型冠状病毒。制备:荧光探针的制备是以新型冠状病毒的RNA特异性片段为模板,通过人工合成的带有放射性或荧光标记的单链DNA片段。【素养案例】(2020浙江选考)下列关于基因工程的叙述,正确的是()A.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定B.抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定
18、遗传转基因品系,抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关C.抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株,其DNA检测均含目的基因,抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNAD.已知不同分子量DNA可分开成不同条带,相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后,出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置【解析】选D。本题主要考查基因工程的内容。若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶,则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割,不利于其保持结构稳定,A项错误;抗除草剂基因转入
19、抗盐植物,获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系,不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入抗盐基因内,影响其表达造成的,B项错误;转基因植物中均含抗除草剂基因,但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株,前者表达了抗性蛋白,后者抗除草剂基因可能未转录出mRNA,或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质,C项错误;某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后,出现3条带,即3种不同分子量DNA,因此环状质粒上至少有3个酶切位点,D项正确。【方法规律】解答基因工程基本操作程序题目的一般步骤三辨、三找、一析、一理(1)三辨:分辨限制酶的种类及识别序列和切割位点。在切割目的基因和载体时,一般用同一种限制酶切割,也
20、可用不同的限制酶切割,但两种限制酶切割后产生的黏性末端中碱基要互补配对。(2)三找:找出标记基因、目的基因及其插入位点。一般来说,质粒中至少有一个标记基因,如抗生素抗性基因。明确目的基因的插入位点是在标记基因内部还是在标记基因之外。(3)一析:分析目的基因插入质粒后是否破坏了标记基因。如果质粒中有一个标记基因,插入后一般不破坏标记基因;如果质粒中有两个标记基因,则需看标记基因中是否有插入位点,如果某一标记基因中有插入位点,则目的基因插入质粒后该标记基因被破坏。(4)一理:理清判断目的基因是否导入受体细胞的方法。一般用含有某种抗生素的培养基培养受体菌,如果有两种抗生素抗性基因,还需判断用哪一种抗
21、生素来检测。【跟踪小练】1.(2021河北适应性考试)我国约在7 000年前就开始种植水稻,现在水稻已经成为我国广泛种植的重要作物。提高水分利用效率对于旱作水稻的生产有重要意义。科学家从拟南芥中获取功能基因HARDY(HRD),并将其转入水稻中过量表达,提高了水稻的水分利用效率。回答下列问题:(1)科学家在获取拟南芥HRD基因过程中,采用了增强子作为筛选工具。增强子是一段能增强与其相连基因转录的DNA序列,将增强子插入基因组中可得到若干个突变株系。增强子插入基因外部,可获得基因_突变株;增强子插入基因内部,可获得基因_突变株。(2)提取拟南芥总RNA,经_过程获得总cDNA,利用PCR技术选择
22、性扩增HRD基因的cDNA。以上过程依次需要用到_和_两种工具酶。(3)将HRD的cDNA插入Ti质粒的_上构建重组载体,利用农杆菌侵染水稻细胞并将HRD的cDNA整合到水稻细胞染色体上。为了便于转基因植物的筛选,重组Ti质粒中必须包括_。(4)在干旱条件下,野生型(WT)和HRD增强表达的转基因水稻植株A、B(HRDA、HRDB)的根生物量(根系干重)及叶片蒸腾速率的测定结果如图所示。据图分析转基因水稻耐旱能力增强的原因包括_和_。【解析】本题主要考查基因工程。(1)增强子是一段能增强与其相连基因转录的DNA序列,将增强子插入基因组中可得到若干个基因过表达突变株。增强子插入基因外部,变异类型
23、为基因重组;增强子插入基因内部,可获得基因失活突变株。(2)RNA经过逆转录过程可以获得总cDNA,逆转录所需要的酶为逆转录酶,PCR技术所需要的酶为DNA聚合酶(Taq酶)。(3)将目的基因插入Ti质粒T-DNA上构建表达载体,为了便于转基因植物的筛选,重组Ti质粒中必须包括标记基因。(4)由图1可知,转基因水稻的根生物量比非转基因水稻多,吸水能力更强;由图2可知,转基因水稻的蒸腾速率比非转基因水稻低,失水能力减弱,因此转基因水稻耐旱能力增强。答案:(1)过表达 失活(2)逆转录 逆转录酶 DNA聚合酶(Taq酶)(3)T-DNA 标记基因(4)根生物量增加,吸水能力增强 蒸腾速率下降,失水
24、能力减弱【补偿训练】(2018海南高考)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质,科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞,得到了转基因植株。回答下列问题:(1)用农杆菌感染时,应优先选用黄瓜_(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共同培养,选用这种叶片的理由是_。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白,则表明该重组质粒中_已转移到植物细胞中且能够表达;用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交,发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为11,则说明甜蛋白基因已经整合到_(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。(3)假设某种转基因
25、作物因为受到病毒感染而减产,若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗,应选用_作为外植体进行组织培养。(4)通常,基因工程操作主要有4个步骤,即目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此,基因工程的含义可概括为_。【解析】(1)受伤的双子叶植物如黄瓜叶片能分泌大量的酚类物质,吸引农杆菌向伤口处转移。(2)普通黄瓜原来没有甜蛋白,如果在转基因黄瓜中检测到甜蛋白,说明甜蛋白基因已经转移到黄瓜细胞内,并且得到表达。若甜蛋白基因整合到核基因组中,由于黄瓜为二倍体植物,其基因型可看作Aa(不含甜蛋白基因看作a),与非转基因黄瓜(aa)杂交,后代性状分离比为11;若甜
26、蛋白基因整合到线粒体或叶绿体基因组中,其遗传具有母系遗传的特点,要么后代全有此性状(转基因黄瓜作母本),要么后代都没有此性状(转基因黄瓜作父本)。(3)植物的根尖或茎尖没有或很少有病毒,取这些部位的材料进行植物组织培养可以获得脱毒苗。(4)基因工程的含义是利用体外重组技术或转基因技术,将一种生物的特定基因转移到另一种生物的基因组中,使后者体现出新的遗传特性,从而创造出新的生物类型和生物产品。答案:(1)受伤的 叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质,可吸引农杆菌移向这些细胞(2)甜蛋白基因 核基因组(3)茎尖(4)按照人们的愿望进行设计,并通过体外重组和转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出符
27、合人们需要的新的生物类型2.(2017全国卷)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是_。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用_作为载体,其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有_(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是_(填“蛋
28、白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导。如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示,那么,这一启示是_。【解析】本题主要考查了基因工程的相关知识。(1)人体基因A有内含子,将获得的基因A导入大肠杆菌中,经过转录得到mRNA,因为大肠杆菌没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。内含子部分对应的mRNA序列阻断了蛋白A的合成。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,选用昆虫病毒作为载体,不选用噬菌体作载体的原因是噬菌体的宿主细胞是细菌,噬菌体不能侵染家蚕。(3)大肠杆菌是原核生物,原核生物作为受体细胞,有以下优点:结构简单、繁殖速度快、容易培养等。(4)要检测基因A是否翻译出蛋白A,最准确的方法是利用蛋白A的抗体,因抗体具有特异性,一种抗体只能与特定的蛋白质结合,可根据蛋白A抗体的杂交情况来判断是否合成了蛋白A。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中将一种生物个体的DNA转移到了另一种生物个体中,并表达合成了相应的蛋白质。答案:(1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕(3)繁殖快,容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体