1、第2课时课前预习使用说明与学法指导1.回顾上节课凝胶色谱法和电泳的原理。2.掌握凝胶色谱法分离蛋白质的操作以及电泳操作过程。知识准备 凝胶色谱法和电泳的原理教材助读1、 蛋白质的提取和分离蛋白质的提取分离一般分为四步： 、 、 、 。 2、 样品处理（1）红细胞的洗涤：洗涤的目的是： ，采集的血样药及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯中，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次直到 ，表面红细胞已洗干净。（2）血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的液体分4层，第1
2、层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体是 ，第3层为红色透明液体这是 ，第4层为其他杂质的暗红色沉淀。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。（4）透析：取1ml血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300ml 20mmol/L的 中，透析12h。透析可以去除样品中的 杂质或用于更换样品的 3、凝胶色谱操作首先要制作 ；第二步是 ，因为 ，所以装柱前要根据色谱柱的体积计算所需要的凝胶量。在填充凝胶柱时，不得有 存在，避免降低分离效果；第三步是 。（一） 血液的组成成分 水分 血浆 无机盐、葡萄糖等血液 白细胞 血细胞 血小板 两个-肽链 红细
3、胞 血红蛋白 两个-肽链 最多 四个亚铁红素基团（二）实验操作1.样品处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。2.样品的粗分离方法：透析 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内目的：除去样品中分子量较小的杂质。3.样品的纯化：通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去（1）
4、凝胶色谱柱的制作：、取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。、底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。、顶塞的制作：打孔安装玻璃管。、组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。、安装其他附属结构（2）凝胶色谱柱的装填、凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。、凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算
5、并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。、凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。、洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离
6、效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。（3）样品加入与洗脱、调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。、滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。、样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。、洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。、收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动
7、，说明色谱柱制作成功）、注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。4.样品的纯化鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定预习自测题1为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）ANaCI B甲苯 C蒸馏水D柠檬酸钠2初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为（ ）AH2 CO3一NaHCO3缓冲液 BNH4OHNH4Cl缓冲液CCH3 COOHCH3 COONa缓冲液 DH3PO4缓冲液课内探究质疑探究洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水?在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这一特点
8、对分离有什么意义/.实验操作中透析的目的是什么？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？归纳总结血红蛋白提取分离：首先，洗涤红细胞，释放血红蛋白、离心；然后通过透析将样品粗分离；再制作凝胶色谱柱进行样品纯化；最后，SDS凝胶电泳鉴定样品是否为血红蛋白。知识网络图 样品处理 洗涤红细胞，释放、离心。 样品的粗分离 透析血红蛋白的提取与分离 样品的纯化 凝胶色谱柱 样品的鉴定 SDS凝胶电泳当堂检测 1蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）A样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳B样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定2. 血红蛋白
9、因含有什么物质而呈红色（ ）A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素3. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀4分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于（ ）A一 B二 C三 D四5. 下列操作正确的是（ ）A. 分离红细胞时采用低速长时间离心B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h6洗涤红细胞的目的是（ ）A去除血清 B去除杂蛋白 C除去血小板 D除去水7洗涤红细胞时
10、，分离所用的方法为（ ）A低速长时间离心 B低速短时间离心 C高速长时间离心 D高速短时间离心8制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是（ ）A移液管头部5cm B移液管尾部5cm C移液管头部3cm D移液管尾部3cm9下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是（ ）A先加入1 mL透析后的样品 B加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出C如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功D洗脱时可以用缓冲液也可以用清水课后反思 请将学习总结写在下面课后训练 一、单选题1装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应（ ）A先打开后关闭 B关闭 C先关闭后打开 D打开2D亚铁血红素基
11、团可携带（ ）A一分子CO B一分子NO C一分子O2或CO2 D一分子NO23人体正常的血红蛋白中应含有Fe2+，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe2+。转化为Fe3+，产生高价铁血红蛋白而中毒。服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反应中（ ）A亚硝酸盐是还原剂 B维生素C是氧化剂 C亚硝酸盐被氧化 D维生素C将Fe3+还原为Fe2+4加有少量柠檬酸钠(防止血液凝固)的猪血分装于标号、的试管中，随后依次加入质量分数为03、09和15的氯化钠溶液稀释，30 min后离心。下列叙述中，正确的是（ ）A和试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞B和试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有
12、皱缩的红细胞C和试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞D和试管的上清液是血清5在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是（ ）A磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 B血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C防止血红蛋白被02氧化 D让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能6在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现 阴极附近的颜色逐渐加深，这说明（ ）AFe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动 BFe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动CFe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动 DFe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动
13、7. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D. 可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度8. 凝胶色谱法操作正确的是（ ）A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B. 将橡皮塞下部切出凹穴C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片9. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝
14、胶面下面B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面10. 下列说法不正确的是（ ）A. 血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40体积的甲苯，充分搅拌B. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体C. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物D. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液二、多选题11下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是（ ）A采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。C在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来12凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1.6cm，有关说法中，正确的是（ ）A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果B凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大