1、什么是动物细胞融合技术？单克隆抗体是如何制备的？在临床上有哪些应用？动物细胞融合技术与单克隆抗体 CONTENTS 目录 动物细胞融合技术 Animal cell fusion technique01单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application02习题巩固 Exercises to consolidate0300植物体细胞杂交技术 Somatic hybridization of plantsA细胞B细胞A原生质体B原生质体正在融合的原生质体杂种细胞 愈伤组织 杂种植株 移栽后的植株去除细胞壁 纤维素酶 去壁：酶解法 果胶酶 诱导融合物理法
2、：化学法电融合法、离心法聚乙二醇（PEG）融合法高Ca2+-高pH融合法等细胞壁再生脱分化再分化移栽植物细胞融合 植物组织培养 去除细胞壁 Animal cell fusion technique01 动物细胞融合技术 运用植物体细胞杂交技术，可以跨越不同植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术能让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？动物细胞融合技术 动物细胞融合技术 Animal cell fusion techniquePART 01 Animal cell fusion technique01 动物细胞融合技术 1.概念：2.结果：动
3、物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞形成一个细胞的过程。形成的具有原来 的 细胞，称为 。单核 两个或多个细胞遗传信息 杂交细胞 3.原理：细胞膜的流动性 Animal cell fusion technique01 动物细胞融合技术 4.动物细胞融合的方法：与植物原生质体融合的方法相同物理方法：动物细胞没有细胞壁，可以直接诱导融合。电融合法、离心法化学方法：聚乙二醇（PEG）法生物方法：灭活病毒诱导法灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，并不破坏它们的抗原结构。动物细胞融合特有 Animal cell fusion technique01 动物细胞融合技术 思考：19世
4、纪30年代，科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。肺结核病人病理切片原理是什么？Animal cell fusion technique01 动物细胞融合技术 原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。Animal cell fusion technique01 动物细胞融合技术 5.构建动物细胞融合模型：融合过程:细胞膜融合细胞质融合 _融合。重组细胞的特点:具有_,杂种细胞表现出两个_的特点
5、。融合后的杂交细胞经过_后仍能形成两个完整的杂交细胞。动物细胞A 动物细胞B 膜融合、质融合 动物细胞培养 杂交细胞（单核）物理、化学、生物法诱导 细胞核 亲本细胞 有丝分裂 两种细胞的遗传信息 动物细胞融合实质及完成的标志 Animal cell fusion technique01 动物细胞融合技术 6.意义：7.应用：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。Comparison of animal cell fusion and plant somati
6、c hybridization01 动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术的比较 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞融合前的处理方法 诱导细胞融合的方法 细胞融合成功的标志 主要用途 意义 细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能单克隆抗体及其应用
7、 Monoclonal antibody and its applicationPART 02 02单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application 向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需抗体。产量低，纯度低，制备的抗体特异性差、反应不灵敏 反复 注射 动物体内 抗原 多种浆细胞 多种抗体（血清）每一个浆细胞只能产生一种特异性抗体 体内产生的特异性抗体多达百万种 缺点 02单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application 动物会接触多种天然抗原，体内相应产生的特异性
8、抗体种类可以达到百万种以上，但每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。因此，要想获得大量的单一抗体，必须克隆单一的淋巴细胞，形成细胞群。遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的。在体外培养条件下，如何让一个B淋巴细胞无限增殖？一个B淋巴细胞B淋巴细胞群单克隆抗体克隆产生02单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application为什么B淋巴细胞能不能无限增殖？单个B淋巴细胞寿命有限，又因为能产生抗体的B淋巴细胞属于高度分化的细胞，不能无限繁殖不可能无限增殖。1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：解
9、决米尔斯坦【英国】科勒【德国】把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞就能大量增殖，产生足够数量的特定抗体。02单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application基本思路 一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞融合 杂交瘤细胞产生足够数量的特定抗体大量增殖单克隆抗体单克隆抗体：由单个B淋巴细胞经过克隆（无限增殖），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体。既能迅速大量增殖，又能产生抗体02单克隆抗体及其应用制备过程 Monoclonal antibody an
10、d its applicationPreparation process用特定的抗原免疫，从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。培养骨髓瘤细胞多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合多种杂交细胞BB、B瘤、瘤瘤*不是为了得到抗体！02单克隆抗体及其应用制备过程 Monoclonal antibody and its applicationPreparation process杂交瘤细胞(既能迅速大量增殖，又能产生抗体)多种杂交细胞 用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。在培养液中加入氨
11、基嘌呤，收集杂交瘤细胞！小资料：细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，可是能不断分裂增殖。02单克隆抗体及其应用制备过程 Monoclonal antibody and its applicationPreparation process对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 杂交瘤细胞 分泌的抗体能与特定抗原结合 02单克隆抗体及其应用制备过程 Monoclonal antibody
12、and its applicationPreparation process将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个进行培养（克隆化培养）一段时间后，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）AB1、AB2、AB3 02单克隆抗体及其应用制备过程 Monoclonal antibody and its applicationPreparation process抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 体外培养 注射到小鼠腹腔内 将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠
13、腹腔内增殖。单克隆抗体 从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。02单克隆抗体及其应用制备过程 Monoclonal antibody and its applicationPreparation process既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体的杂交瘤细胞02单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选）筛选原因 方法 筛选结果 诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合细胞等用特定的选择培养基进行筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长。筛选出融合的杂
14、种细胞选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的细胞。筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞02单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application项目 腹腔培养 体外培养 优点 缺点 易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低 规模小，产量少 可大规模培养，大量生产 需要人为控制培养条件，成本相对较高 02单克隆抗体及其应用制备过程 Monoclonal antibody and its applicati
15、onPreparation process单克隆抗体筛选二杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养筛选一骨髓瘤细胞诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术既能大量繁殖又能产生专一抗体特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原细胞增殖 细胞膜具有流动性 02单克隆抗体及其应用应用 Monoclonal antibody and its applicationApplication资料1 用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对
16、胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。女性怀孕后会分泌一种糖蛋白人绒毛膜促性腺激素（HCG），尿液中会检出HCG的存在。用抗HCG单克隆抗体制备的试纸可以测试女性是否怀孕。作为诊断试剂(最广泛的用途)02单克隆抗体及其应用应用 Monoclonal antibody and its applicationApplication资料2 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体一药物偶联物（antibody-drugconjugate,ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗
17、原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。02单克隆抗体及其应用应用 Monoclonal antibody and its applicationApplication单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素）=ADC02单克隆抗体及其应用应用 Monoclonal antibody and its applicationApplication用于疾病的治疗和运载药物(主要用于癌症的治疗)单克隆抗体：(1).特异性强、灵敏度高生物导弹单抗抗癌药物 原理：(2).疗效高、毒副作用小：不损伤正常细胞，减少剂量导向作用
18、，将药物定向带到癌细胞所在位置抗癌药物：杀死癌细胞02单克隆抗体及其应用应用 Monoclonal antibody and its applicationApplication抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。ADC的抗体和药物各具有什么作用？讨论102单克隆抗体及其应用应用 Monoclonal antibody and its applicationApplication可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将
19、这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？讨论202单克隆抗体及其应用应用 Monoclonal antibody and its applicationApplication单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？讨论3
20、02单克隆抗体及其应用 Monoclonal antibody and its application两个过程 动物细胞融合过程 单克隆抗体制备过程 三个“一”一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒 一个新细胞 杂交瘤细胞 一个优势 单克隆抗体特异性强、灵敏度高、可大量制备的优势 习题巩固 Exercises to consolidatePART 03 03习题巩固 Exercises to consolidate1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前
21、者主要为了获得细胞产品，后者主要为了获得杂种植株C03习题巩固 Exercises to consolidate2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A03习题巩固 Exercises to consolidate3.假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用这种技术来解决哪些问题？解决这些问题的大致思路是怎样的？这样做会有什么风险？请查阅相关资料，完善自己的思路，并形成文字报告，与同学交流。可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来些伦理方面的问题。课时作业 THANK YOU