1、第34讲基因工程A组基础过关1.如图表示利用植物细胞工程对棉花进行改良的过程,表示实验过程,请据图回答,下列说法正确的是 ()A.外源基因能够导入并大量复制的物质基础是自然界共用一套密码子B.过程能定向改变原生质体的遗传特性C.过程只能通过液体悬浮培养技术才能实现D.基因工程技术与花药离体培养技术相结合可快速获得纯合棉花植株答案B外源基因能够导入并大量复制的物质基础是外源基因与棉花叶肉细胞DNA的基本组成单位都是脱氧核苷酸,A错误;基因工程能定向改造生物的性状,B正确;培养愈伤组织时用固体培养基,C错误;通过花药离体培养得到单倍体幼苗后再用秋水仙素处理才能获得纯合植株,D错误。2.下列关于载体
2、的叙述中,错误的是()A.载体与目的基因结合后,实质上就是一个重组DNA分子B.对某种限制性核酸内切酶而言,载体最好只有一个切点,但还要有其他多种酶的切点C.目前常用的载体有质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒D.载体具有某些标记基因,便于对其进行切割答案D载体必须具备的条件:对受体细胞无害,不影响受体细胞正常的生命活动;具有自我复制能力,或能整合到受体细胞的染色体DNA上,随染色体DNA的复制而同步复制;具有一个至多个限制性核酸内切酶切点,以便目的基因可以插到载体中;带有特殊的标记基因,如抗生素抗性基因,以便于对外源基因是否导入进行检测;载体DNA分子大小适合,以便于提取和进行体外操作。3.科研
3、人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中,培育新花色的矮牵牛。请回答:(1)为了获得大量的目的基因,将其与含有抗生素抗性基因的质粒DNA形成重组DNA,再与经(A.氯化钙B.氯化钠C.蔗糖D.葡萄糖)处理的大肠杆菌液混合,使重组DNA进入大肠杆菌。用的玻璃刮刀将稀释后的大肠杆菌液接种到含有抗生素的固体培养基上,经培养形成,再进行鉴定和扩大培养。(2)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA,用分别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒,然后用DNA连接酶连接,形成重组DNA并导入农杆菌。(3)取田间矮牵牛的幼嫩叶片,经自来水冲洗,先用70%浸泡,再用5%次氯酸钠浸泡,最
4、后用清洗,作为转基因的受体材料。(4)将消毒后的矮牵牛叶片剪成小片,在含有目的基因的农杆菌溶液中浸泡后,取出并转移至加有适当配比生长调节剂的MS培养基(含蔗糖、琼脂和抗生素,下同)上,使叶小片先脱分化形成,再将其转移至另一培养基诱导形成芽,芽切割后转移至(A.LB培养基B.MS培养基+适宜浓度NAAC.MS培养基+适宜浓度BAD.NAA/BA小于1的MS培养基)上生根,形成完整植株。(5)取出试管苗,在适宜的光照、温度和80%以上的等条件下进行炼苗。提取叶片组织的DNA,采用PCR技术目的基因,鉴定目的基因是否成功导入。(6)为判断本研究是否达到预期目的,可比较转基因植株和非转基因植株的性状。
5、答案(1)A灭菌涂布菌落(2)限制性核酸内切酶(3)酒精无菌水(4)愈伤组织B(5)湿度扩增(6)花色解析(1)将重组质粒导入大肠杆菌细胞,需先用氯化钙处理大肠杆菌,增加其细胞壁的通透性,便于重组质粒进入。常用的微生物分离的方法有划线分离法和涂布分离法,其中涂布分离法需要用经过灭菌的玻璃刮刀将菌液涂布接种到相应的培养基上,经过培养会在培养基上形成菌落。(2)切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒,需要用到限制性核酸内切酶。(3)矮牵牛的幼嫩叶片经自来水冲洗后,先用70%的酒精浸泡,再用5%的次氯酸钠浸泡,最后用无菌水清洗,作为转基因的受体材料。(4)导入目的基因的离体组织在有适当配比生长调节
6、剂的MS培养基中脱分化形成愈伤组织,然后再分化形成植株,其中诱导生根时需要有适宜浓度的NAA。(5)获得试管苗后,需要在适宜的光照、温度和80%以上的湿度条件下炼苗。鉴定目的基因是否导入受体细胞时,可采用PCR技术对DNA进行扩增。(6)判断是否达到预期目的,即确定已知花色基因是否导入牵牛花的核基因组中,可直接从个体水平将转基因植株与非转基因植株的花色性状进行比较。4.(2018课标全国,38,15分)回答下列问题:(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了(答出两点即可)
7、。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。答案(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)体外重组的质粒可以
8、进入受体细胞,且重组质粒在不同细胞中能正常表达,说明目的基因在不同细胞中的表达机制相同,生物界共用一套遗传密码。(2)基因工程中,受体细胞为大肠杆菌细胞时,常用Ca2+处理大肠杆菌,使之处于感受态,即Ca2+参与的转化法。噬菌体DNA与外壳蛋白组装成完整噬菌体。因噬菌体的宿主是细菌,故只有细菌可作为重组噬菌体的宿主细胞。(3)为防止目的基因表达的蛋白质被破坏,可选用不能合成蛋白酶的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化过程中加入蛋白酶的抑制剂可以保护蛋白质不被水解。5.(2018天津理综,10,14分)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗
9、的新方法,主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的进行分子杂交鉴定,筛选获得
10、成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是(单选)。A.病毒的DNA聚合酶B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起免疫,增强免疫保护效果。答案(1)PCR多肽(或蛋白质)(
11、2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞解析本题主要考查基因工程的相关知识。(1)利用PCR技术体外扩增DNA。若将基因中个别编码氨基酸的序列替换为编码终止密码子的序列,则改造后的基因转录合成的mRNA中,终止密码子提前出现,将不能控制合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)目的基因只有与载体连接后才能导入宿主细胞。可提取宿主细胞的总RNA进行分子杂交鉴定,以筛选获得成功表达题述tRNA的转基因宿主细胞。(3)由(2)知,转基因宿主细胞含有的特殊tRNA基因转录的tRNA,该tRNA的反密码子可与终止密码子配对,并可携带非天然氨基酸(Uaa),所以培养基中需补加非天然氨基酸(Ua
12、a)。病毒中的基因进行转录时,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因该病毒疫苗具有侵染性,故可引起细胞免疫。B组能力提升1.(2018北京理综,5,6分)用Xho 和Sal 两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()图1酶切位点图图2电泳结果示意图A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图2中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道中是用Sal处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA答案D图1中,两种限制性核酸内切酶的酶切位点不同,说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同,A正确。图2中,两种酶的酶切产物都为DNA
13、片段,都可用于构建重组DNA,B正确。结合图1的酶切位点图,判断两种酶切DNA后得到的DNA片段数;再结合泳道电泳结果知,泳道是用Sal处理得到的酶切产物,C正确。能被限制性核酸内切酶酶切的DNA片段仍为双链DNA,D错误。2.(2017浙江4月选考,28,2分)若利用根瘤农杆菌转基因技术将抗虫基因和抗除草剂基因转入大豆,获得若干转基因植株(T0),从中选择抗虫抗除草剂的单株S1、S2和S3,分别进行自交获得T1,T1性状表现如图所示。已知目的基因能1次或多次插入并整合到受体细胞染色体上,下列叙述正确的是()A.抗虫对不抗虫表现为完全显性,抗除草剂对不抗除草剂表现为不完全显性B.根瘤农杆菌Ti
14、质粒携带的抗虫和抗除草剂基因分别插到了S2的2条非同源染色体上,并正常表达C.若给S1后代T1植株喷施适量的除草剂,让存活植株自交,得到的自交一代群体中不抗虫抗除草剂的基因型频率为1/2D.若取S3后代T1纯合抗虫不抗除草剂与纯合不抗虫抗除草剂单株杂交,得到的子二代中抗虫抗除草剂的纯合子占1/9答案C据图分析,抗除草剂对不抗除草剂表现为完全显性,A错误;若抗虫基因和抗除草剂基因分别插到了S2的2条非同源染色体上并成功表达,则S2自交后代会出现不抗虫不抗除草剂的个体,而实际并未出现这样的后代,B错误;若给S1后代T1植株喷施适量除草剂,存活的抗虫抗除草剂植株不抗虫抗除草剂植株=21,抗虫抗除草剂
15、植株自交后代不抗虫抗除草剂植株的比例为2/31/4=1/6,不抗虫抗除草剂植株自交后代全为不抗虫抗除草剂植株,占1/3,因此,后代不抗虫抗除草剂植株的基因型频率=1/6+1/3=1/2,C正确;S3后代T1纯合的抗虫不抗除草剂与纯合的不抗虫抗除草剂单株杂交,子二代中抗虫抗除草剂的纯合子占1/16,D错误。3.2018浙江4月选考,32(二),7分回答与基因工程和植物克隆有关的问题:(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI 121均用限制性核酸内切酶EcoR酶切,在切口处形成。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI 121用DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成,获得重组质
16、粒。(2)已知用CaCl2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是,从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。(3)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行,然后接种到培养基中培养,幼胚发生形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及。(答出2点即可)。答案(1)粘性末端磷酸二酯键(2)转化使CaCl2处理过的农杆菌
17、恢复细胞的正常状态(3)消毒脱分化水稻的基因型、愈伤组织继代的次数解析(1)用同种限制性核酸内切酶切割基因载体,可获得相同的粘性末端,通过DNA连接酶连接,在两个片段相邻处形成磷酸二酯键,从而获得重组质粒。(2)经CaCl2处理过的农杆菌,成为感受态细胞,与重组质粒混合,使后者进入细胞,从而完成转化实验。将其置于摇床慢速培养一段时间,使经CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态,从而能表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。(3)田间获取的水稻幼胚,需要先消毒处理,后接种培养,经脱分化形成愈伤组织,并进行继代培养。影响愈伤组织能否再生出植株的因素,除了培养条件,还有水稻本身的基因型这一内因,也跟继
18、代培养次数有关。4.埃博拉病毒(EBO)呈纤维状,病毒衣壳外有包膜,包膜上有5种蛋白棘突(VP系列蛋白和GP蛋白),其中GP蛋白最为关键,能被宿主细胞强烈识别。科研人员利用该病毒进行了一系列的研究。请回答下列问题:(1)用GP蛋白作为疫苗比较安全,其原因是。(2)生产疫苗过程中首先要获得编码GP蛋白抗原的基因,方法是先提取出病毒的RNA,再将RNA,要大量获得该基因,可釆用PCR技术进行扩增,该项技术中需要用到酶,该酶需从的末端开始催化子链的延伸。(3)在基因导入牛受体细胞前,基因的首段必须含有使其仅能在牛的乳腺细胞中特异性表达的,才能驱动转录过程。转基因牛是否培育成功,可以通过技术从分子水平
19、进行检测。(4)科研人员也可以利用经EBO免疫后小鼠的与鼠的骨髓瘤细胞进行融合,形成杂交瘤细胞,培养后可以获得纯净的单一品种抗体,其特点是,可以用此抗体与药物制成“生物导弹”,抗击EBO。答案(1)GP蛋白自身没有感染能力(2)逆转录合成DNA耐高温的DNA聚合(Taq)引物(3)(乳腺蛋白基因的)启动子抗原抗体杂交(4)B淋巴细胞特异性强、灵敏度高、并可大量制备解析(1)用GP蛋白作为疫苗比较安全,其原因是GP蛋白自身没有感染能力,但是保留有抗原性。(2)RNA在逆转录酶的催化下,可逆转录出相应的DNA。用PCR技术扩增目的基因时需要耐高温的DNA聚合(Taq酶)的催化,该酶需从引物的末端开
20、始催化子链的延伸。(3)基因的首段必须含有使其仅能在牛的乳腺细胞中特异性表达的启动子,才能驱动转录过程。转基因牛是否培育成功,可以通过抗原抗体杂交技术从分子水平进行检测。(4)科研人员利用经EBO免疫后的小鼠的B淋巴细胞与鼠的骨髓瘤细胞进行融合,筛选后进一步培养得到杂交瘤细胞,杂交瘤细胞既能产生单一抗体,又能在体外快速增殖。单克隆抗体具备的特点是特异性强、灵敏度高、并可大量制备。5.科学家将拟南芥的抗寒基因(CBFl),转入香蕉以获得抗寒的香蕉品种。如图是某质粒载体上的Sac、Xba、EcoR、Hind四种限制酶的切割位点示意图。据图回答问题:(1)在该实验中为构建基因表达载体,用Sac、Xb
21、a切下CBFl基因后,对质粒载体进行切割的限制酶是,理由是。(2)连接CBFl基因到该质粒载体后,作为基因表达载体的组成还必须有。将重组质粒导入香蕉细胞最常用的方法是。(3)为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因,可用含的培养基进行筛选。(4)科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行处理,鉴定两组之间的抗寒性差异,如果,则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。答案(1)Sac、Xba用相同限制酶切割来源不同的DNA后,可产生相同的末端(2)启动子和终止子农杆菌转化法(3)氨苄青霉素(4)低温实验组的抗寒能力明显高于对照组解析(1)在基因工程中,用相同限制酶切割来源不
22、同的DNA后,可产生相同的末端,所以和含目的基因的DNA一样,质粒也应使用Sac、Xba进行切割。(2)基因表达载体的组成包括启动子、终止子、标记基因、目的基因等。香蕉细胞是植物细胞,将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(3)据图分析,质粒上的标记基因是氨苄青霉素抗性基因,所以为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因,可用含氨苄青霉素的培养基进行筛选。(4)根据题干信息已知目的基因是抗寒基因,所以科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行低温处理,鉴定两组之间的抗寒性差异,如果实验组的抗寒能力明显高于对照组,则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。6.(2016课标
23、全国,40,15分)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后,与用BamH酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有 (答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。(2)如果用含
24、有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是;并且和的细胞也是不能区分的,其原因是。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有的固体培养基。(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自于。答案(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞解析(1)质粒作为载体应具备的基本条件有:能自我复制、具有标记基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因,所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因,插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因,所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素的培养基,筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒,病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。