1、动物细胞工程发展历程希普：首例胚胎移植成功哈里森:首创动物组织体外培养法张明觉：发现哺乳动物精子获能现象格登、童第周：体细胞核移植成功试管家兔诞生米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术胚胎分割移植成功埃文斯：成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞克隆羊多莉诞生山中伸弥：获得诱导多能干细胞单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。1890年1907年1951年1958年1959年1975年1978年1981年1996年2006年2014年2017年Animal cell engineering00 动物细胞工程 动物细胞培养 动物细胞融合 动物细胞核移植 动物细胞工程的基
2、础 一、动物细胞培养动物细胞培养是指从动物体中取出相关的，将它们分散成，然后在下，让这些细胞和的技术。生长 组织 单个细胞 适宜的培养条件 增殖 1.定义：Animal cell culture00 动物细胞培养 动物体 组织 单个细胞 细胞生长和增殖 取出 分散 适宜条件（1）相关组织：一般是指动物胚胎或幼龄动物的组织，因为这些组织或细胞的生命力旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养。（2）适宜的培养条件：不同的细胞、组织适合生存的环境不同，需要配置不同的培养基。充足的营养、稳定的内环境2.原理：细胞增殖3.目的：获得细胞或细胞产物动物细胞培养需要哪些基本条件？动物细胞培养的基本操作过程是什
3、么？怎样客观分析干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？动物细胞培养 From society00 从社会中来 在治疗大面积烧伤时，通常采用的方法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且会产生免疫排斥反应。那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？可以从病人身上取少量正常、健康的皮肤在体外进行培养、扩增。目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。CONTENTS 目录 动物细胞培养的条件 Conditions of animal cell culture
4、01 动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture02 干细胞培养及其应用 Stem cell culture and its application03 习题巩固 Exercises to consolidate04 动物细胞培养的条件 Conditions of animal cell culturePART 01 Conditions of animal cell culture01 动物细胞培养的条件 动物细胞培养的条件营养物质其他条件糖类、氨基酸无机盐、维生素 无菌、无毒的环境适宜温度、pH和渗透压适宜的气体环境Conditions of
5、animal cell culture01 动物细胞培养的条件 1.营养合成培养基+合成培养基：将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基称为合成培养基。血清等一些天然成分：由于人们对细胞所需的营养物质尚未全部研究清楚。血清可以补充合成培养基中缺乏的物质，如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等。细胞培养时，一般需添加10%20%的血清或血浆。一般使用液体培养基，也称为培养液。血清等一些天然成分 Conditions of animal cell culture01 动物细胞培养的条件 2.无菌、无毒的环境对培养液和所有培养用具进行灭菌处理在无菌环境下进行操作可根据实际情况适量添加抗生
6、素无菌清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。无毒 定期更换培养液和 Conditions of animal cell culture01 动物细胞培养的条件 3.温度、pH和渗透压一般与动物体内相同 适宜的温度：适宜的pH：多数动物细胞生存的适宜pH为。7.2-7.4适宜的渗透压：维持细胞正常的形态和功能。4.气体环境气体的组成及作用95%空气5%CO2培养装置:哺乳动物细胞培养的温度多以为宜。36.50.5培养皿或松盖培养瓶CO2培养箱置于维持培养液的pH细胞代谢所必需动物细胞培养的过程 The process of animal cell culturePART 02 02动
7、物细胞培养的过程 The process of animal cell culture体外培养的动物细胞可以分为两大类：悬浮培养瓶 第1类：悬浮生长细胞细胞能够悬浮在培养液中生长增殖第2类：贴壁生长细胞细胞需要贴附于某些基质(如培养瓶壁)表面才能增殖(主要类型)这些细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上，这种现象称为细胞贴壁。接触抑制 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture思考：“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，出现接触抑制的现象”试结合上述解释，举例说
8、明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因。癌细胞；癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少 02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture传代培养取动物组织制成细胞悬液原代培养放入CO2培养箱中培养放入CO2培养箱中培养用机械的方法，或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理的方法，将组织分散成单个细胞转入培养液中进行02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture机械方法 胰蛋白酶处理 胶原蛋白酶处理 动物 组织块 分散成 单个细胞 加培养液 细胞悬液 原代培养 放入培养瓶 在适宜条件 在适宜条件 分瓶培养 传代培养 1.取材
9、：2.原因:细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养。动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。（一）取动物组织：02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture机械方法 胰蛋白酶处理 胶原蛋白酶处理 动物 组织块 分散成 单个细胞 加培养液 细胞悬液 原代培养 放入培养瓶 在适宜条件 适宜 条件 分瓶 培养 传代培养（二）取动物组织：1.将组织分散成单个细胞 原因:a.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖；b.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。保证细胞所需的营养物质的供应及有害产物的及时排出。02动物细胞培养的过程 The
10、 process of animal cell culture常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？说明细胞间的物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以用胃蛋白酶不行。胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗，为什么？细胞膜的成分中含有蛋白质，而胰蛋白酶能够水解蛋白质，因此，胰蛋白酶会把细胞消化掉。因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture机械方法 胰蛋白酶处理 胶原蛋白
11、酶处理 动物 组织块 分散成 单个细胞 加培养液 细胞悬液 原代培养 放入培养瓶 在适宜条件 传代培养 适宜 条件 分瓶 培养 2.用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶。原代培养将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经过处理后的初次培养称为原代培养。传代培养 将分瓶后的细胞培养称为传代培养。培养瓶或培养皿要求：内表面光滑、无毒、易于贴附。02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture机械方法 胰蛋白酶处理 胶原蛋白酶处理 动物 组织块 分散成 单个细胞 加培养液 细胞悬液 原代培养 放入培养瓶 在适宜条件 传代培养 适宜 条件 分瓶
12、 培养 悬浮生长 贴壁生长(大多数）细胞密度过大有害代谢物积累培养中营养物质缺乏接触抑制细胞分裂受阻需要02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture进行传代培养(分瓶培养)时，如何处理？悬浮细胞 贴壁细胞 离心法收集 胰蛋白酶处理 制成细胞悬液 分瓶培养 02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。思考：正常细胞能否一直传代培养下去？第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养，为原代培养。第二次：细胞培养过程中出现接触抑制
13、，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养，为传代培养。02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture传代培养部分细胞的细胞核型可能会发生变化，增殖缓慢，甚至完全停止大部分细胞衰老死亡少数细胞会克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正朝癌细胞发展1050代继续培养（50代以后）（有限细胞系）（无限细胞系）使用或保存的细胞通常为10代以内，以保持细胞正常的二倍体核型(遗传物质不改变)。这一阶段的细胞称为细胞株细胞系的遗传物质一定改变02有关动物细胞培养的问题 Questions about anima
14、l cell culture1.幼龄动物的细胞与老龄动物的细胞比较，分化程度低的细胞与分化程度高的细胞比较，哪些细胞更容易培养？为什么？细胞增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来说，幼龄动物细胞比老龄动物细胞易于培养。分化程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。2.动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。02植物组织培养与动物细胞培养比较 Comparison between plant tissue culture and animal cell cu
15、lture比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 培养基性质 培养基特有成分 培养过程 培养结果 培养目的 植物细胞的全能性细胞增殖固体液体植物激素动物血清脱分化、再分化原代培养、传代培养植物体动物细胞群快速繁殖植物得到动物细胞及细胞产物相同点：培养基中都需要加入营养物质、培养过程中都需要防止杂菌污染、都需要提供适宜的温度、pH和渗透压的条件。02动物细胞培养的过程 The process of animal cell culture机械方法 胰蛋白酶处理 胶原蛋白酶处理 动物 组织块 分散成 单个细胞 加培养液 细胞悬液 原代培养 放入培养瓶 在适宜条件 传代培养 适宜 条件 分瓶 培养
16、 悬浮生长 贴壁生长(大多数）细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等 细胞贴壁、接触抑制 细胞分裂受阻 制成细胞悬液，分瓶培养 收集细胞 悬浮培养的细胞:直接用离心法收集 贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集 干细胞培养及其应用 Stem cell culture and its applicationPART 03 发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例 03干细胞培养及其应用干细胞 Stem cell culture and its applicationStem cell干细胞 早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。胚胎
17、干细胞成体干细胞诱导多能干细胞定义 分布 种类 发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例 03干细胞培养及其应用胚胎干细胞（ES细胞）Stem cell culture and its applicationEmbryonic stem cell胚胎干细胞 早期胚胎中需要分化诱导因子诱导分布 特点 应用实例 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能 在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等（4）局限性必须从胚胎中获取，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例 03干细胞培养及其应用成体干细胞 Stem
18、cell culture and its applicationAdult stem cell成体干细胞 成体组织或器官内造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中）神经干细胞（神经系统中）精原干细胞（睾丸中）具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例分布 举例 特点 有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。（3）应用1.应用原理：03干细胞培养及其应用成体干细胞 Stem cell culture and its applicationAdult stem cell2.应用实例：治疗神经组织损伤
19、和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。造血干细胞：神经干细胞：干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。3.面临的问题：存在导致肿瘤发生的风险4.应用展望：治疗细胞损伤造成的疾病 发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例 03干细胞培养及其应用诱导多能干细胞（iPS细胞）Stem cell culture and its applicationInduced pluripotent stem cells诱导多能干细胞 通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞 将特定基因或特
20、定蛋白导入细胞（成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞）用小分子化合物诱导形成诱导过程无须破坏胚胎；iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。概念 制备方法 优点 03（3）应用移植取成纤维细胞等iPS细胞转入相关因子细胞发生转化分化胰岛细胞神经元血细胞肠上皮细胞心肌细胞肝细胞病人iPS细胞用于治疗人类疾病示意图干细胞培养及其应用诱导多能干细胞（iPS细胞）Stem cell culture and its application Induced pluripotent stem cells取成纤维细胞转入相关因子细胞转化为iPS细胞诱导iPS细胞定向
21、分化为多种组织细胞移植回病人体内03干细胞培养及其应用 Stem cell culture and its application类型 应用 造血干细胞 神经干细胞 诱导多能干细胞（iPS细胞）治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）可治疗小鼠的镰状细胞贫血症，在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展干细胞应用面临的问题存在存在着导致肿瘤发生的风险。无菌、无毒营养温度、pH和渗透压气体环境制备细胞悬液原代培养传代培养动物细胞培养动物细胞培养的条件动物细胞培养的过程干细胞的培养和应
22、用干细胞的种类、特点及应用iPS细胞的培养和应用习题巩固 Exercises to consolidatePART 04 04习题巩固 Exercises to consolidate1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。（1）培养环境中需要O2，不需要CO2。（）（2）细胞要经过脱分化形成愈伤组织。（）（3）培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清（）（4）培养瓶中的细胞需定期用胰蛋白酶处理,分瓶后才能继续增殖（）04习题巩固 Exercises to consolidate2.干细胞有着广泛的应用前景。下列相关叙述错误的是()A.干细胞是从胚胎中分离提取的细胞B.造血干
23、细胞可以分化为各种血细胞C.不同类型的干细胞,它们的分化潜能是有差别的D.由iPS细胞产生的特定细胞,可以在新药的测试中发挥重要作用A04习题巩固 Exercises to consolidate现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施?像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的i
24、PS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。04习题巩固 Exercises to consolidate（2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。课时作业 THANK YOU