1、选修3现代生物科技专题第37讲基因工程考纲展示核心素养1.基因工程的诞生()。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)()。3.基因工程的应用()。4.蛋白质工程()。1.生命观念结构决定功能：基因的结构与功能。2科学思维建立模型：基因工程的操作流程。3科学探究解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程。考情统计2018全国卷(38)；2018全国卷(38)；2017全国卷(37)；2017全国卷(37)；2017全国卷(37)；2016全国卷(40), 基础梳理一、基因工程的操作工具1限制性核酸内切酶(简称限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用：识别双链DNA分子的某种特
2、定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)结果：产生黏性末端或平末端。2DNA连接酶种类Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3.载体(1)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。(2)种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。(3)条件二、基因工程的基本操作程序1目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。(2)获取方法2基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。使目
3、的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子及标记基因等。3目的基因导入受体细胞受体细胞类型方法植物细胞农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法动物细胞显微注射技术(注射到受精卵内)微生物细胞感受态细胞法(Ca2处理法)4.目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNADNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交技术是否出现杂交带个体水平的检测如抗虫、抗病的接种实验是否表现出相应的特性三、基因工程的应用及蛋白质工程1基因工程的应用(1)动物基因工程：用于提高
4、动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。2基因诊断与基因治疗(1)基因诊断：又称为DNA诊断，采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或是否携带病原体。(2)基因治疗概念：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入取自患者的淋巴细胞中，使淋巴细胞能产生腺苷酸脱氨酶，然后，再将这种淋巴细胞转入患者体内，从而治疗
5、复合型免疫缺陷症。3蛋白质工程(1)操作手段：基因修饰或基因合成。(2)结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。(3)设计流程四、DNA的粗提取与鉴定1实验原理(1)提取原理DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。DNA不溶于酒精溶液。(2)鉴定原理：DNA二苯胺试剂蓝色。2实验流程基础小练1判断正误(1)限制酶只能用于切割目的基因。()(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。()(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。()(4)Ecoli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()(5)质粒
6、是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()(6)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。()(7)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。()(8)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。()(9)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。()(10)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术。()2思维探究据图分析抗虫棉的培育过程：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？提示：目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得
7、相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？提示：采用的方法是农杆菌转化法；由于Ti质粒上的TDNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了TDNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？提示：抗原抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。锁定高考一限制性核酸内切酶1限制性核酸内切酶的作用(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称。无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如，以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，
8、两侧碱基互补对称。(2)切割后末端的种类2限制酶的特点与使用(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(3)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。|针对练习|1(2016
9、年全国卷)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。
10、解析：(1)由题图可知，BamH和Sau3A两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH酶切后得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。答案：(1)Sau3
11、A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶2(2019年江苏卷)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为_末端。(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为_的脱氧核苷酸，形成P
12、2；P2和目的基因片段在_酶作用下，形成重组质粒P3。(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“”代表生长，“”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是_(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_、_。菌落类型平板类型ABC无抗生素氨苄青霉素四环素氨苄青霉素四环素(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是_。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段
13、，原因是_。解析：(1)根据题意分析，EcoR V酶识别的序列是，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。(2)据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且漏出的碱基为A，则在载体P1的两端需要加一个碱基T形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。(3)根据以上分析可知，限制酶切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在四环素中不能生长，而在氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌
14、落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。(4)根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。答案：(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)BA类菌落含有P0C类菌落未导入质粒(4)乙、丙目的基因反向连接|拓 展 提 升|选择限制酶的技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma。为
15、避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因，所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因。锁定高考二基因工程中的运载体1应具备的条件(1)能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。(2)具有一个至多个限制酶切点，可供外源DNA片段插入。(3)具有标记基因，可供重组DNA的鉴定和选择。2与膜载体的区别基
16、因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。3载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：|针对练习|3(2016年全国卷)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示
17、四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分
18、的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。解析：(1)质粒作为载体，应具备的基本条件：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌
19、和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。答案：(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素(3)受体细胞锁定高考一目的基因的获取1几种获取目的基因方法的比较方法从基因文库中获取人工合成从基因组文库中
20、获取从部分基因文库，如cDNA文库中获取化学合成法逆转录法2.PCR技术(1)PCR原理：DNA复制原理，即：(2)PCR反应过程过程说明图解变性温度上升到90 以上，双链DNA解聚为单链复性温度下降到55 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到72 左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5端向3端延伸(3)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。|针对练习|1(2017年全国卷)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核
21、生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_作为载体，其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是_(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可
22、以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_。解析：(1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为
23、基因工程的受体细胞。(4)常用抗原抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。答案：(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A(2)噬菌体噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕(3)繁殖快、容易培养(4)蛋白A的抗体(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体2(2019年全国卷)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：(1)基因工程中
24、所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括_和_。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是_。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_。解析：(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是解旋酶。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的
25、条件是加热至9095 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。答案：(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至9095 氢键(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活锁定高考二基因表达载体的构建、目的基因的导入和检测1基因表达载体2农杆菌转化法原理植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌农杆菌中Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上，则目的基因将被一起带入)
26、。3目的基因检测与鉴定的“两个水平”|针对练习|3(2018年全国卷)回答下列问题：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2参与的_方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与_组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实
27、验中应选用_的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加_的抑制剂。解析：(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外重组的质粒可通过Ca2处理，以增大细胞的通透性，使重组的质粒能够导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞，噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的
28、基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。答案：(1)体外重组的质粒可以进入体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶4(2017年全国卷)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取
29、几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_。解析：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩
30、叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。答案：(1)嫩叶组织细胞
31、易破碎防止RNA降解(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(4)磷酸二酯键(5)目的基因的转录或翻译异常1体外基因治疗与体内基因治疗的区别方法比较体外基因治疗体内基因治疗不同点途径从患者体内获得某种细胞体外完成基因转移筛选、细胞扩增输入体内直接向患者体内组织细胞中转移基因特点操作复杂，但效果可靠方法较简单，但效果难以控制相同点,都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段2.蛋白质工程与基因工程的关系 项目区别与联系 蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结
32、构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造, |针对练习|1(2019届大庆质检)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子链N端第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的
33、_序列发生改变。(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作_(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作_。(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的_，以其作为模板，在_酶的作用下反(逆)转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和_酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取_，用相应的抗体进行_杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。解析：(1)编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。(2)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，
34、实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质或基因进行改造，因此不属于蛋白质工程。(3)因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反(逆)转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。(4)目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质，进行抗原抗体杂交实验加以判断。答案：(1)碱基对(或脱氧核苷酸)(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰)(3)mRNA(或RNA)逆转录DNA连接(4)蛋白质抗原抗体2(2015年全国卷)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305
35、个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰_基因或合成_基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物
36、_进行鉴定。解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如图所示：由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以R
37、NA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列合成DNA表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他答案合理也可)(2)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能1DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同溶解规律2 mol/LNaCl溶液0.14 mol/LNaCl溶液DNA溶解析出蛋白质NaCl溶液物质的量浓度从
38、2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大部分发生盐析沉淀溶解2.DNA粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”加蒸馏水2次加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水破裂；加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出用纱布过滤4次过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液；滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；再次过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；用0.14 mol/L的NaCl溶液使DN
39、A析出；用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA|针对练习|1(2019年江苏卷)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是()A用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近BDNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNAD用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热解析：选A兔属于哺乳动物，其红细胞没有细胞核及各种细胞器，提取不到DNA，而鸡属于禽类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，A错误；DNA分子从细胞中被释放出来且除去蛋白后是非常容易断裂的，如果太过剧烈的搅拌
40、，DNA链可能会被破坏，因此轻柔搅拌的目的是获得较完整的DNA分子，B正确；在冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度最低，沉淀量最大。如果用热的95%酒精会提高DNA的溶解度，不能完全使DNA沉淀，C正确；将析出的DNA溶解在2 mol/L 的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后需要水浴加热才会呈现蓝色，D正确。2(2019届南京期末)全血是由液态血液和各种血细胞组成，是常见的临床检测材料，如何从血液中快速、高效地分离和提取基因组DNA，对于临床血液检验与分析非常重要，科研人员对比分析了超声波处理法(方法A)、高盐法(方法B)、改良高盐法(方法C)等三种快速提取大鼠全血基因组DNA的方法。实验过程如图
41、，请分析回答：(1)在全血中加入的抗凝剂一般是质量浓度为0.1 g/mL的_。(2)多组实验数据发现，用大鼠全血为实验材料可提取到少量DNA的原因是_。(3)三种实验方法中，方法_破碎细胞的效率高、成本低。方法B中加入蛋白酶K抑制了RNA酶的活性，从而使得到的溶液中_含量高于DNA。(4)步骤中加入NaCl的目的是_，步骤利用异丙醇纯化DNA的原因是_。(5)得到含DNA的溶液后进行鉴定，需向其中加入_，沸水浴加热，_后变蓝。解析：(1)为了防止血液凝固，实验前应在全血中加入0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂，防止血液凝固。(2)大鼠为哺乳动物，虽然红细胞中无细胞核和线粒体，没有DNA，
42、但全血中含有各种白细胞，白细胞细胞核和线粒体含有DNA，故用大鼠全血为实验材料可以提取到少量DNA。(3)三种实验方法中，由于方法C采用了漩涡振荡器，剧烈振荡，因此方法C破碎细胞的效率高、成本低。方法B因为加入蛋白酶K抑制了RNA酶的活性，得到的溶液中RNA含量高于DNA。(4)步骤中加入NaCl的目的是溶解DNA，DNA不溶于异丙醇，而杂质能溶于异丙醇，步骤中加入异丙醇的作用是使DNA析出。(5)得到含DNA的溶液后进行鉴定，需向其中加入二苯胺，沸水浴加热，冷却后变蓝。答案：(1)柠檬酸钠溶液(2)全血中含有各种白细胞，白细胞含有细胞核和线粒体(3)CRNA(4)溶解DNADNA不溶于异丙醇
43、，而杂质能溶于异丙醇(5)二苯胺冷却易错澄清易错点一基因工程所需酶的特点及作用点拨(1)在切割目的基因和载体时用同一种限制酶，目的是产生相同的末端。(2)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个末端。(3)不同DNA分子用同一种限制酶切割，产生的末端都相同；同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的末端一般不相同。(4)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。易错点二载体的理解点拨基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜上载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。易错点三几组易错概念的区分点
44、拨(1)基因表达载体中，启动子(DNA片段)起始密码子(位于mRNA)；终止子(DNA片段)终止密码子(位于mRNA)；(2)基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。结论语句1限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。2质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。3基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。4培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵，培育转基因植物时的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。5目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；
45、导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。6目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。1(2019年江苏卷)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是()A将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌B将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株C将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛D将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗解析：选D将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌，重组质粒能随细菌分裂而遗传给后代，A错误；将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株细胞
46、中都含花青素代谢基因，因而能遗传给后代，B错误；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛细胞中都含肠乳糖酶基因，因而能遗传给后代，C错误；将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗时不会改变其他细胞的基因组成，且淋巴细胞不能进行减数分裂，产生配子，所以不会遗传给子代，D正确。2(2018年北京卷)用Xho 和Sal 两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()A图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B图2中酶切产物可用于构建重组DNAC泳道中是用Sal处理得到的酶切产物D图中被酶切的DNA片段是单链DNA解析：选D通过图
47、1可知，两种限制性核酸内切酶切割DNA分子的不同部位，说明两种限制性核酸内切酶识别的核苷酸序列不同；图2中的酶切产物是DNA分子片段，可用于构建重组DNA；观察图1可知，该DNA片段有3个Sal酶切位点，故用Sal处理后，可形成4个DNA分子片段，电泳后出现4条电泳带，与电泳条带对应；限制性核酸内切酶作用的是双链DNA片段，因此图中被酶切的DNA片段应是双链DNA。3(2017年北京卷)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是()A用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒B用含C基因的农
48、杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞C在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上解析：选C目的基因C和质粒都有可被EcoR切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素；使用分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体细胞染色体上。4(2019年海南卷)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。(1
49、)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取_作为模板，在_催化下合成cDNA，再利用_技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的_中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_。(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是_。解析：(1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因
50、，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的
51、脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。答案：(1)mRNA逆转录酶PCR(2)TDNA整合到叶肉细胞染色体DNA上(3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基5(2018年全国卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白L1基因连接在GFP基因的5末端，获得了L1GFP融合基因简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结
52、构和酶切位点的示意图如下，图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题：(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_。使用这两种酶进行酶切是为了保证_，也是为了保证_。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了_和_过程。(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_移入牛的_中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的_(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”
53、)作为PCR模板。解析：(1)由题意可知，L1基因和GFP基因形成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时又能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在，PCR扩增的模板是核DNA。答案：(1
54、)E1和E4甲的完整甲与载体正确连接(2)转录翻译(3)细胞核去核卵母细胞(4)核DNA6(2017年江苏卷)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过_获得_用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。(3)图中步骤1代表_，步骤2代表退火(复性)，步骤3
55、代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时，退火(复性)温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火(复性)温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火(复性)温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_填序号：升高退火(复性)温度降低退火(复性)温度重新设计引物。解析：(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)在设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，
56、设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火(复性)，步骤3为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火(复性)温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火(复性)温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故G、C含量高的引物需要设定更高的退火(复性)温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火(复性)温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火(复性)温度、重新设计引物等。答案：(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板G、C含量高(5)
