1、微生物的培养技术及应用 什么是培养基？如何配制？什么是无菌技术？怎样进行酵母菌的纯培养？录 目 Contents 1 2 3 4 培养基的配置 Medium configuration无菌技术 Aseptic technique微生物的纯培养 Pure culture习题巩固 Exercises to consolidate问题探讨 Problems discussed 向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样
2、才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。这需要应用无菌技术和微生物的培养技术 微生物的类群 The taxa of microorganisms微生物 个体无法用肉眼观察的微小生物。无细胞结构原核细胞真核细胞真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履虫、变形虫等微生物的类群病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒细菌:蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌等；放线菌:链霉菌等培养微生物的条件 Conditions for culture of microorganisms要为人们需要的微生物提供合适的_条件。要确
3、保，并将需要的微生物分离出来。营养和环境其他微生物无法混入 微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。实验室培养微生物的条件培养基 无菌技术 Part 1 培 养 基 的 配 置 Medium configuration培养基的配置 Medium configuration培养基 1.概念：3.类型：2.作用：人们按照微生物对 的不同需求，配制出供其_的营养基质。营养物质 生长繁殖 用以培养、分离、鉴定、保存微生物或。（提供微生物繁殖所需各种营养，异养微生物的能源）积累其代谢物 固体 培养基 液体 培养基 有无琼脂 分离、计数、鉴定等 扩大培养、工业
4、生产 培养基的配置 Medium configuration注意说明 加入培养基中的凝固剂（如琼脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。扩大培养获得大量菌种时，常用液体培养基。一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体培养基的配置 Medium configuration4.营养构成：（1）基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源：无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物氮源：无机氮源：NH4、NO3-、NH3等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳
5、源、氮源、能源无机盐：Ca、K、Mg为大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素牛肉膏、蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质 各种有机物 蛋白质、核酸 培养基的配置 Medium configuration（2）特殊需求：满足微生物对、的需求。特殊营养物质pHO2培养厌氧微生物时，需要提供的条件。培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加；培养霉菌时，需要将培养基调至；培养细菌时，需要将培养基调至；维生素酸性中性或弱碱性无氧表1-1 1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1
6、000ml水维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等 主要提供碳源的是牛肉膏，主要提供氮源的是蛋白胨。Part 2 无菌技术 Aseptic technique无菌技术 Aseptic technique1.获得纯净的微生物培养物的关键是。防止杂菌污染消毒：是指使用较为的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死的微生物，包括芽孢和孢子。2.防止杂菌污染的方法：温和物体内外所有目的：防止培养物被污染；防止感染实验操作者。避免已经灭菌的材料用具与周围物品接触；为了避免周围环境微生物污染，操作应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。无菌技术 Aseptic techni
7、que消毒 使用较为温和的物理、化学或生物等方法，杀死物体表面或内部一部分微生物。（1）概念：（2）消毒的方法：煮沸消毒法：巴氏消毒法：化学药剂消毒法：紫外线消毒法：用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。100煮沸5-6min。62-65下煮30min 或 80-90下煮30s-1min。用70%酒精擦拭双手；氯气消毒水源。无菌技术 Aseptic technique灭菌 湿热灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法 1.湿热灭菌法高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121下维持15-30min1.原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。2.优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某
8、些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。3.对象：培养基等。无菌技术 Aseptic technique灭菌 干热灭菌法干热灭菌箱内160170 下加热23h。1.原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等2.对象：耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌无菌技术 Aseptic technique灭菌 灼烧灭菌法 常用于涂布器、接种环、接种针、试管口或其它金属用具等的灭菌。直接在酒精灯火焰的充分燃烧层（外焰）灼烧。1.效果：最彻底2.原理：使微生物燃烧3.对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的
9、试管口或瓶口等易被污染部位类型 适用范围 操作方法 消 毒 灭 菌 较为温和理化方法，杀死部分微生（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活100 煮沸56 min巴氏消毒法不耐高温的液体6265 煮30 min或80-90 煮30s-1 min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30 min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160170 加热23h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验
10、室常用高压蒸汽灭菌锅内,100 kPa,温度121,1530 min接种室、接种箱，超净工作台Part 3 微生物的纯培养 Pure culture微生物的纯培养 Pure culture1.培养物：在微生物学中，将接种于内，在合适条件下形成的含的群体。培养基 特定种类微生物 3.纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。2.纯培养物：由所获得的微生物群体。单一个体繁殖 步骤：1）配制培养基2）灭菌3）接种4）分离5）培养酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast菌落 1.概念：2.特征：分散的微生物(单一个体)在适宜的 表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的 。固体培
11、养基 子细胞群体 形状、大小、光泽度、颜色、透明度等。是鉴定菌种的重要依据 3.获得单菌落的方法：平板划线法 稀释涂布平板法 酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast方法步骤 接种和分离 培养酵母菌 制备培养基 1.制备培养基配制培养基 灭菌 倒平板 1）配制培养基称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast方法步骤 2）灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭
12、菌锅中，在压力为100kPa、温度为121的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170灭菌2h。包器材酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast方法步骤 3）倒平板待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板注意事项：温度：50左右操作：在酒精灯火焰附近冷凝后平板倒置酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，
13、造成污染。酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast方法步骤 2.接种和分离酵母菌 通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。平板划线法 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。单个细胞 微生物群 单个菌落 连续划线 分散或稀释 生长繁殖 灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红 在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞 在火焰附近用接种环蘸取一环菌液 将皿盖打开一条缝隙，将沾有
14、菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。试管口通过火焰，并塞上棉塞 试管口通过火焰 灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。平板划线法 Plate marking连续划线法 分区划线法 划3个平板（重复实验）1个不划线（空白对照）1）一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；2）存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。“平板划线”实验操作 平板划线法 Plate marking分区划线法 12345接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次划线首尾不能相接
15、每次划线前接种环进行灭菌划线后,培养皿倒置培养平板划线法注意事项:平板划线法 Plate marking1.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。2.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。平板划线法 Plate marking3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期 目的 取菌种前 每次划线前 接种结束
16、后 杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者 杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞 杀死接种环上原有微生物 酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast方法步骤 3.培养酵母菌完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28左右的恒温培养箱中培养24-28h。既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染 酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast方法步骤 4.结果分析与
17、评价1.在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。2.你是如何记录实验结果的？可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast方法步骤 4.结果分析与评价3.在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生
18、长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。酵母菌的纯培养 Pure culture of yeast评估论点的可信程度 所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和
19、提高免疫力”的论点值得怀疑。Part 4 习题巩固 Exercises to consolidate习题巩固 Exercises to consolidate1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（）（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。（）（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（）习题巩固 Exercises to consolidate2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的
20、水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。习题巩固 Exercises to consolidate3.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？提示（1）：培养皿和培养基。提示（2）：接
21、种。习题巩固 Exercises to consolidate（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？提示：通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。习题巩固 Exercises to consolidate4.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min，230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？提示：意味着培养液中02含量不同。习题巩固 Exercises to consolidate（2）从图中数据你可以得出什么结论?其原因是什么?提示：培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定?提示：这时候已经达到了环境容纳量。Thank you for watching 课时作业
