1、生物选修1（人教版）专题5 DNA和蛋白质技术 课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段要点突破一、生物体内的DNA复制与PCR反应的比较 DNA单链有方向性，DNA母链的3端对应着子链的5端，即DNA的两条链是反向平行的。注意不同酶的作用：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3端上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。例1 标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A92、50、72 B72、50、92 C50、92、72 D80
2、、50、72 解析：当温度上升到90 以上(9096)时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50左右(4060)时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72(7075)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。答案：A变式训练 1PCR技术中，引物的作用是()A打开DNA双链 B催化合成DNA子链 C使DNA聚合酶能够从引物的3端开始复制 D提供模板 解析：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，引物的作用就在于此。答案：C 二、PCR技术的基本原理 类似于
3、DNA的天然复制过程，由变性复性延伸三个基本反应步骤构成：1模板DNA的变性 模板DNA经加热至95 左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的DNA的双链解开，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。2模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3引物的延伸 DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为反应原料，DNA母链为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性复性延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新
4、链又成为下次循环的模板。每完成一个循环需24 min，23 h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR扩增过程中的易错点PCR过程中无解旋酶，破坏氢键需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度还不能破坏磷酸二酯键，因此，热变性后是DNA单链，并未分解成单体。复性时只是在引物和DNA单链之间形成氢键，两条单链之间并未形成氢键，因此复性后，无双链DNA分子形成。三、PCR的实验操作 1操作步骤(1)按PCR反应体系的配方配制所需试剂。(2)用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分。(3)盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。(4)将微量离心管放在离心机上，离心约10 s。(5)将离心管放在
5、PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。以上过程可以概括为准备、移液、混合、离心、反应五大步。2实验结果与分析(1)实验中DNA含量的测定。稀释：取2 L PCR反应液，加入98 L蒸馏水，即将样品稀释了50倍对照调零：以蒸馏水作空白对照，在波长260 nm处，将紫外分光光度计的读数调至零。测定：取DNA稀释液100 L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。计算：DNA含量(g/mL)50(260 nm的读数)稀释倍数。(2)理论上DNA扩增数目的计算。DNA扩增与DNA复制一样，呈指数扩增。若只有一个DNA为模板，则复制n次后有2n个；若一开始有a个模板，则复制n次有a2n个DNA。(3)D
6、NA扩增是否成功。检测DNA片段扩增情况可以采用上述方法，也可以采用电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分、各反应成分的用量不当、PCR程序设置不当等。例2 下列操作过程的叙述中错误的是()APCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌BPCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存CPCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换解析：从冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应
7、放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化。答案：C变式训练 2在PCR实验操作中，下列说法不正确的是()A在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头 B离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢 C用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合 D离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果 解析：在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10 s的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。答案：A 本节小结核心归纳 1DNA复制需要引物，是因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。2PCR反应需要的条件有模板、引物、耐热的DNA聚合酶、原料(四种脱氧核苷酸)、温度控制设备及一定的缓冲液。3PCR每次循环分为变性、复性和延伸三步，对应的温度分别为95 、55 和72 。4PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。