1、第十单元现代生物科技专题专题二十五基因工程考点1基因工程的基本工具与操作程序1.2018北京理综,5,6分用Xho和Sal两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是()A.图1中两种酶识别的核苷酸序列不同B.图2中酶切产物可用于构建重组DNAC.泳道中是用Sal处理得到的酶切产物D.图中被酶切的DNA片段是单链DNA本题结合电泳图谱考查基因工程中限制酶的相关知识,包括限制酶的作用特点、功能、作用对象等。解题的关键是牢记限制酶识别的是双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。2.2019全国卷,38,15分基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回
2、答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库中获得。基因文库包括和。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。基因工程是选修3模块的重要主干知识,近五年高考全国卷多次考查,占据绝对优势。历年高考对基因工程的考查大多集中在质粒的结构、限制酶的选择和重组质粒的构建等知识点上,2019年高考对此部分知识的考查有新变化,侧重考查PCR技术及其与细胞
3、内DNA复制的异同,突显了高考对主干知识常考常新的命题理念。3.2016全国卷,40,15分 某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后,与用BamH酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题: (1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有(答出两点即可),而作为
4、基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是;并且和的细胞也是不能区分的,其原因是。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有的固体培养基。(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自。高考对选修部分的考查不再仅仅局限于简单的填空,而是更侧重于语言表达能力的考查,比如本题第(2)小题中“其原因是”的形式在近几年的高考中多次出现,预计高考还会以这种形式进行考查。解答本小题的关键是明
5、确被转化的大肠杆菌的特点,即含有环状目的基因的大肠杆菌无氨苄青霉素抗性基因,不能在含氨苄青霉素的培养基上生长;含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌有氨苄青霉素抗性基因,能在含氨苄青霉素的培养基上生长。考点2基因工程的应用与蛋白质工程4.2019海南,31,15分人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y),该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。(1)若要获得Y的基因,可从人的T细胞中提取作为模板,在催化下合成cDNA,再利用技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌T
6、i质粒上的中,得到含目的基因的重组Ti质粒,则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织,则说明Y的基因已经。(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性,若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性,具体思路是。本题结合实例考查基因工程和蛋白质工程的关系。解答有关蛋白质工程的试题,需要考生联系中心法则的知识,并能进行逆向思维,从蛋白质的功能出发,逆推到核苷酸序列上,落实了对考生科学思维这一核心素养的考查。5.2018全国卷,38,15分某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激
7、发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。回答下列问题:(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是。使用这两种酶进行酶切是为了保证,也是为了保证。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了和过程。(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生
8、绿色荧光细胞的移入牛的中、体外培养、胚胎移植等。(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。本题将基因工程与胚胎工程相结合,考查考生的综合运用能力。解答本题第(1)小题的关键是要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达,目的基因的首端应有启动子,尾端应有终止子,从而确定只有使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整,而且也保证了甲与载体正确连接,进而再作答。 考点1基因工程的基本工具与操作程序 考法1 基因工程的基本工具与操作程序分析命题角度1基因工程的操作工具分
9、析1 2016全国卷,40,15分图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamH 酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理由是 。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ,不能表达的原因是 。(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有 和 ,其中既能连接黏性
10、末端又能连接平末端的是 。解答本题需注意两个关键,一是关键信息:图(a)中三种酶的识别序列,图(b)中终止子、启动子的位置,图(c)中目的基因的插入位置。二是关键知识:只有两种限制性核酸内切酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端,才能被DNA连接酶连接;启动子是启动目的基因转录的,终止子终止转录过程,插入二者之间的目的基因才能正常表达。(1)由图(a)可知,尽管BamH和Sau3A两种限制酶的识别位点不相同,但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端,故被BamH酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3A酶切后的产物连接。(2)载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达
11、的作用,由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游,故这两个载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是Ecoli DNA连接酶和T4DNA连接酶,但作用有所差别,T4DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端,而Ecoli DNA连接酶只能连接黏性末端。(1)Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录(3)Ecoli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶归纳总结 对限制酶切割位点的三点要求1.位置要求:在只有一个标记基因的情况下,限制酶切割位
12、点所处的位置必须在标记基因外,只有这样才能保证标记基因的完整性。2.数量要求:选择限制酶切割目的基因时,被选择的限制酶在目的基因的两侧都要有识别序列,这样才能切割出完整的目的基因。3.对象要求:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将二者切割,但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端相同,则两末端也可连接。 1.2016江苏,33,9分如表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点,其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题:限制酶BamHBclSau3AHind识别序列及切割位点 G GATC CC CTAG G T GAT
13、C AA CTAG T GATCCTAG A AGCT T T TCGA A图1图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用 两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过 酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒,需将其转入处于 态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加,平板上长出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物组成为图2中 。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列为 ,对于该部位,这两种酶 (填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得 种大小不同的DN
14、A片段。命题角度2基因工程操作程序分析2 2018全国卷,38,15分回答下列问题:(1)博耶(H. Boyer)和科恩(S. Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了(答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验
15、中应选用的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。本题考查了基因工程中的相关知识。(1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达,因此,该研究可以证明:质粒可以作为载体、真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)将质粒导入大肠杆菌时,常用的转化方法是首先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使其成为感受态。噬菌体DNA没有侵染能力,体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中,但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解,则大
16、肠杆菌体内不能存在蛋白酶,因此,实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理,在蛋白质纯化过程中,也不能使蛋白质降解,因此,应添加蛋白酶抑制剂。(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达(2)转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌(3)蛋白酶缺陷型蛋白酶核心素养解读 本题主要考查的核心素养是科学思维,具体表现在两个角度:核心素养角度具体表现归纳与演绎以非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行表达,归纳质粒的作用比较与分类质粒载体和噬菌体载体受体细胞的类型不同分析与综合选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞的原因2.2019天津理综,9,12分B基因
17、存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。据图回答:(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中(单选)。A.含B基因的染色体缺失B.DNA聚合酶失活C.B基因发生基因突变D.B基因的启动子无法启动转录(2)从水稻体细胞或中提取总RNA,构建文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。(3)在过程、转化筛选时,过程中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程在培养基
18、中应加入卡那霉素。(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是(多选)。A.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明。命题角度3PCR技术的基本操作和应用3 2018江苏,32,8分为生产具有特定性能的-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了-淀粉酶基因(1 656
19、个碱基对),利用基因工程大量制备-淀粉酶,实验流程如图。请回答下列问题:(1)利用PCR技术扩增-淀粉酶基因前,需先获得细菌的。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的端加上限制性酶切位点,且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是。(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中的设定与引物有关,的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)如图表示筛选获得的工程菌中编码-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列:5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU-3图中虚线框内mRNA片段包含个密码子
20、,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个密码子最多有种。(5)获得工程菌表达的-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性,结果如表所示:缓冲液50 mmol/LNa2HPO4-KH2PO450 mmol/LTris-HCl50 mmol/LGly-NaOH pH6.06.57.07.57.58.08.59.09.09.510.010.5酶相对活性%25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果,初步判断该-淀粉酶活性最高的条件为。(1)利用PCR技术扩增-淀粉酶基因前,需先获得细菌的基因组D
21、NA。(2)构建重组DNA分子时,需用限制性核酸内切酶处理目的基因和载体,故需要在引物的5端添加限制性酶识别序列,且常在两条引物上设计添加不同的限制性酶切位点,这样可以使DNA片段按照一定方向插入表达载体,防止目的基因或载体自身的黏性末端之间相互连接以及目的基因与载体反向连接。(3)利用PCR技术进行扩增时,退火温度的设定是成败的关键,退火温度过高会使引物无法与模板的碱基配对,所以退火温度的设定与引物有关;延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。(4)密码子由mRNA上相邻的3个碱基组成,所以该片段的24个碱基包含8个密码子。该片段后面的第一个碱基为U,所以后面的密码子最多可能有44=16(种),
22、根据题干信息及题中给出的mRNA序列可知,虚线框后第一个密码子不可能是终止密码子,所以实际最多有13种密码子。(5)由表格数据可知,该-淀粉酶活性最高的条件是pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl。(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连(3)(4)813(5)pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl3.2017江苏,33,8分金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。 PCR扩增过程示意图如下,请回答下列问题:(1)从高
23、表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA,通过获得用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的位点。 设计引物时需要避免引物之间形成,而造成引物自连。(3)图中步骤1代表,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR 扩增时,退火温度的设定是成败的关键。 退火温度过高会破坏的碱基配对。 退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有(填序号:升高退火温度降低退火温度重新设计引物)。 考点2基因工程的应
24、用与蛋白质工程 考法2 基因工程的应用和蛋白质工程分析命题角度4结合实例考查基因工程的应用4 2018天津理综,10,14分甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的 ,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原基因等其他基因分别构建重组质粒,并保存。(2)
25、构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与 连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的 进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加 的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是 (单选)。A.病毒的DNA聚合酶B.宿主的DNA聚合酶C.病毒的RNA聚合酶
26、D.宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起 免疫,增强免疫保护效果。(1)在基因工程中,通过逆转录产生的DNA可以通过PCR技术扩增。若基因内个别编码氨基酸的序列被替换成编码终止密码子的序列,则会导致翻译时肽链合成提前终止,因此改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽链。(2)将合成特殊tRNA的基因导入宿主细胞前需构建基因表达载体,因此需将该基因与载体连接。要鉴定宿主细胞中tRNA基因是否导入,需提取宿主细胞的总RNA,用标记的目的基因作探针,进行分子杂交,若
27、出现杂交带,说明tRNA基因转录产生了tRNA。(3)据(2)中信息,设计的特殊tRNA基因转录产生的tRNA能携带一个非天然氨基酸,因此需将宿主细胞在含有这种非天然氨基酸的培养基中进行培养,以便该特殊tRNA基因转录产生的tRNA能够与非天然氨基酸结合。特殊tRNA基因转录需要RNA聚合酶参与,识别其启动子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)病毒活疫苗能够侵入宿主细胞,引起机体的细胞免疫,因此与灭活疫苗相比,病毒活疫苗的优势之一是其可以引起细胞免疫,增强免疫保护效果。(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)细胞4.2018海南,31,15分甜蛋白是一种高
28、甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质,科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞,得到了转基因植株。回答下列问题:(1)用农杆菌感染时,应优先选用黄瓜(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养,选用这种叶片的理由是 。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白,则表明该重组质粒中已转移到植物细胞中且能够表达;用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交,发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1,则说明甜蛋白基因已经整合到(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产,若要以该转基因作物为材料获得脱毒
29、苗,应选用作为外植体进行组织培养。(4)通常,基因工程操作主要有4个步骤,即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此,基因工程的含义可概括为 。命题角度5基因工程与蛋白质工程的关系分析5 2015新课标全国卷,40,15分已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶的催化活性。回答下列问题:(1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的 进行改造。(2)以P基因序列为基础,获得
30、P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中心法则的全部内容包括 的复制,以及遗传信息在不同分子之间的流动,即。 (3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质功能出发,通过和,进而确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋白质,之后还需要对蛋白质的生物进行鉴定。(1)蛋白质的功能由蛋白质的三维结构决定,而蛋白质的三维结构与氨基酸序列有关,因此,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的氨基酸序列进行改造。(2)P基因与P1基因的根本区别是碱基序列不同,因此可以通过对P基因进行修饰获得P1基因,也可以直接合成P1基因。中心法
31、则的内容可以通过图示体现:(3)蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)(2)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNARNA、RNADNA、RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能5.2015海南,31,15分在体内,人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链,此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原,进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后,产生A、B两条肽链,再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰
32、岛素。目前,利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题:(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是,合成胰高血糖素的细胞是。(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的序列,用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成的基因工程菌。(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,则用该工程菌进行工业发酵时,应从中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。1.D不同的限制酶识别序列不同,A项正确;限制酶切割的产物可用于构建重组DNA,B项正确;泳道显示四个条带,是Sal处理后的酶切产
33、物的电泳结果,泳道显示三个条带,是Xho处理后的酶切产物的电泳结果,C项正确;限制酶的作用特点是识别特定DNA序列,并在DNA两条链特定部位切割产生黏性末端或平末端,D项错误。2.(除标明外,每空2分)(1)基因组文库cDNA文库(2)解旋酶加热至9095 (3分)氢键(3)Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活(4分)【解析】本题考查基因文库和PCR过程等知识,意在考查考生的识记能力和理解能力。(1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的,而在体外利用PCR技术扩增目的基因时,则是通过加热至9095 进行解旋的,二者都
34、破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中,要加热至9095 ,所以使用热稳定性高的Taq酶,而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。3.(除标明外,每空2分)(1)能自我复制、具有标记基因(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长(3分)四环素(3)受体细胞【解析】(1)作为载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点,在细胞中能够自我复制,且含有特殊的标记基因。(2)未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体,而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因
35、,因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因,二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长,因此无法区分二者。根据题图,用BamH切割质粒后将四环素抗性基因破坏,因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选,能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌,不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体为病毒,经改造后作为载体时,其DNA复制所需原料来自受体细胞。4.(除标明外,每空2分)(1) mRNA逆转录酶PCR(2)T-DNA整合到叶肉细胞染色体DNA上(3分
36、)(3)找到第6位氨基酸甲的碱基所在的基因位置,参照密码子表,将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基(4分)【解析】本题考查了基因工程、蛋白质工程的相关知识。(1)由题意可知,蛋白质(Y)是人的T细胞产生的抗体。若要获得Y的基因,可从人的T细胞中提取mRNA作为模板,在逆转录酶催化下合成cDNA,再利用PCR技术在体外扩增获得大量Y的基因。(2)将外源基因导入植物体内常用农杆菌转化法,该方法先将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T-DNA上,然后通过农杆菌的转化作用,使目的基因进入植物细胞并插入到植物细胞的染色体DNA上。(3)蛋白质工程的基本途径是:预期蛋白质的功能设计预期蛋白质的结构推测应
37、有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列。若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性,需找到第6位氨基酸甲的碱基所在的基因位置,参照密码子表,将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。5.(1)E1和E4(2分)甲的完整(2分)甲与载体正确连接(3分)(2)转录(1分)翻译(1分)(3)细胞核(2分)去核卵母细胞(2分)(4)核DNA(2分)【解析】(1)据图示信息分析:将L1-GFP融合基因(甲)插入质粒时使用限制酶E1和E4,既能保证L1-GFP融合基因的完整,又能保证L1-GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养
38、的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中,经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,采用PCR技术鉴定时,应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。1.(除标明外,每空1分)(1)Bcl和Hind连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3)T GATC CA CTAG G G GATC AC CTAG T(2分)都不能(4)7【解析】(1)由题图可知,质粒的两个标记基因中都含有BamH的切割位点,因此不能用BamH进行切割,结合题干及表中信息可知也不能用Sau3A进行切割,所以只能用质粒和目的基因中都含有切割位点的Bc
39、l和Hind这两种限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段,通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。要将重组质粒转入大肠杆菌,要先用CaCl2处理大肠杆菌,使其处于感受态。(2)重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因,所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加四环素,含有重组质粒的大肠杆菌能在该平板上长出菌落。要用PCR扩增目的基因,所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙,因为从图2中可以看出,引物甲与引物丙与模板链结合后能完成目的基因的复制。(3)BamH酶切的DNA末端是GC CTAG,Bcl酶切的DNA末端是TA CTAG,这两个末端连接后的连接部位的
40、6个碱基对序列为T GATC CA CTAG G G GATC AC CTAG T ,由于连接后的6个碱基对序列中没有BamH和Bcl能识别的酶切位点,故对于该部位,BamH和Bcl都不能将其切开。(4)因为质粒的BamH和Bcl识别序列中都有Sau3A的识别序列和切割位点,所以用Sau3A切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。Sau3A切割位点及得到的7种大小不同的DNA片段情况如下:如图所示,切割位点在1的位置可以得到1种DNA分子;切割位点在1和2的位置可以得到2种DNA分子;切割位点在1和3的位置可以得到2种DNA分子;切割位点在2和3的位置可以得到2种DNA分子,故最多可能
41、获得7种大小不同的DNA片段。2.(除标明外,每空2分) (1)D(2)精子cDNA(3)(1分)(1分)(4)BCD(5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚【解析】本题考查基因工程的操作工具及操作程序等相关知识,意在考查考生的识记能力和理解能力。(1)启动子是一段有特殊结构的DNA片段,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA。B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录,推测最可能的原因是卵细胞中B基因的启动子无法启动转录,D符合题意。(2)B基因在体细胞和精子中正常表达,说明在水稻的体细胞和精子中有B基因转录而来的mRNA。从水稻体细胞
42、或精子中提取总RNA,逆转录产生多种互补DNA片段,与载体连接后储存在一个受体菌群中,这个受体菌群体就叫作水稻的cDNA文库。(3)过程是指含有目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌,过程是指将含有重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上。为了检测含有目的基因的重组Ti质粒是否转入农杆菌,过程需在培养基中加入卡那霉素。(4)DNA分子杂交是将转基因生物的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,将探针与基因组DNA杂交,看是否出现杂交带。将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交,不能用于筛选含目的基因的转基因植株,A项
43、错误;B-Luc融合基因中含有水稻B基因编码蛋白的序列和Luc基因,因此,以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交可达到实验目的,B项正确;转基因植株卵细胞中的B基因能够转录出mRNA,因此以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交可达到实验目的,C项正确;Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光,因此检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光,可以达到实验目的,D项正确。(5)一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,而在转基因植株中能发现由未受精的卵细胞发育形成的胚,说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。3.(每空1分)(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内
44、切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5) 【解析】(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增,模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1 和引物2)时,需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列,便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连,设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知,图中步骤1为变性,步骤2为退火(复性),步骤3为延伸,这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数,故
45、GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR 反应得不到任何扩增产物,可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低,也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物,因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。4.(1)受伤的(2分)叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质,可吸引农杆菌移向这些细胞(3分)(2)甜蛋白基因(2分)核基因组(2分)(3)茎尖(3分)(4)按照人们的愿望进行设计,并通过体外重组和转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出符合人们需要的新生物类型(3分)【解析】(1)当植物体受到损伤时,伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物,吸引农杆菌移向这些细胞,因此用农杆菌感
46、染时,优先选用黄瓜受伤的叶片。(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白,说明目的基因(甜蛋白基因)在受体细胞中已经完成表达;若甜蛋白基因整合到线粒体基因组或叶绿体基因组中,在遗传时遵循母系遗传,不会出现固定的分离比,所以子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1,则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。(4)基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,从而创造出符合人们需要的新生物类型和生物产品。5.(每空3分)(1)胰岛B细胞胰岛A细胞(2)DNA胰岛素原(3)菌体【解析】(1)由题意可知,前胰岛素原在细胞内经加工后成为胰岛素,人体合成胰岛素的细胞是胰岛B细胞,故前胰岛素原是在胰岛B细胞中合成的;合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。(2)根据胰岛素原的氨基酸序列,可设计并合成编码胰岛素原的DNA序列(即目的基因);用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成胰岛素原的基因工程菌。(3)根据题意,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原抗体反应,说明胰岛素原在菌体内部,所以用该工程菌进行工业发酵时,应从菌体中分离、纯化胰岛素原,经酶处理便可转变为胰岛素。
