1、-1-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段-2-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航1.能进行PCR技术的基本操作。2.能记住PCR的原理。3.能说出PCR的应用。-3-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航一二三四五一、PCR原理1.细胞内DNA复制所需基本条件DNA分子能准确复制的原因有哪些?提示:DNA双螺旋结构提供模板;碱基互补配对。-4-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHIS
2、HISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航一二三四五2.子链延伸的方向(1)DNA的两条链是反向平行的,通常将DNA的羟基末端称为3端,而将磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3端延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物。(2)DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。3.DNA分子复制的人工控制(1)双链的解开是进行DNA复制的前提。在体外可通过控制温度来实现。在80100 的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。(4)高温可以打开DNA双链,但会导致普通的DNA聚合酶失活。后来
3、耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用,大大增加了PCR的效率。-5-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航一二三四五(3)PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。(4)由于PCR过程的温度高,会导致普通的DNA聚合酶失活,后来耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用,大大增加了PCR的效率。(5)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行,需提供:DNA模板,分别与两条模板链相结合的两种引物,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进
4、行。-6-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航一二三四五二、PCR的反应过程1.PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。2.在循环之前,常要进行一次预变性,以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。3.过程(1)变性:当温度上升到90 以上时,双链DNA解聚为单链。(2)复性:当温度下降到50 左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸:当温度上升到72 左右时,合成新的DNA链。4.从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反应,并且由
5、引物延伸而成的DNA单链会与引物结合,进行DNA的延伸,这样,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数扩增。-7-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航一二三四五三、实验操作在PCR实验中,通常要用到微量离心管。具体操作时,用微量移液器依次加入各种组分。-8-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航一二三四五四、实验注意事项1.为避免外源DNA等因素的污
6、染,PCR实验中使用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2.缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 储存。3.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种成分后,移液器上的枪头都必须更换。所有成分加入后盖严离心管口的盖子。4.混匀后要离心处理,使反应液集中在离心管底部,再放入PCR仪中进行反应。你知道怎样获得大量的乙肝病毒基因吗?提示:采用PCR技术对乙肝病毒基因进行迅速扩增。-9-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航一二三四五五、DNA含量的测定1.理论上DNA扩增呈指数
7、增长,即一条DNA片段循环n次后产物DNA的数目为2n,但实际可能会有诸多因素影响DNA含量,所以需要对DNA含量进行测定。2.DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA的含量有关,可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定。-10-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航比较细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)-11-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航-12
8、-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航题型一题型二题型一PCR的原理及应用【例题1】下列关于PCR的描述,错误的是()A.PCR技术的原理是DNA复制B.PCR是一种酶促反应,需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶C.一个DNA片段经PCR扩增,理论上可以形成2n个DNA片段(n代表循环次数)D.PCR利用DNA的热变性原理来控制DNA的解聚与结合解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,以极少量的DNA为模板,DNA聚合酶从引物的3端连接脱氧核苷酸,短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝。PC
9、R利用DNA的热变性原理来解旋,不需要解旋酶。答案:B-13-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航题型一题型二反思领悟DNA复制时要解螺旋,细胞内DNA的解旋需要解旋酶催化,而体外DNA复制时一般是加热解旋。-14-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航题型一题型二题型二PCR技术操作【例题2】在PCR实验操作中,下列说法错误的是()A.在微量离心管中添加各种试剂时,只需一个枪头B.离心管的
10、盖子一定要盖严,防止液体外溢C.用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合D.离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果解析:在微量离心管中添加各种试剂时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头必须更换,以确保实验的准确性;离心管的盖子一定要盖严,防止实验中脱落或液体外溢;离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效果。答案:A-15-课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段ZHISHISHULI知识梳理DIANLITOUXI典例透析ZHONGNANJUJIAO重难聚焦目标导航题型一题型二反思领悟(1)为避免外源DNA污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前应进行高压灭菌。(2)缓冲液和酶应分装成小份,-20 低温保存。(3)每添加一种反应成分,更换一个移液器的枪头。(4)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。