1、解惑练4新冠病毒的检测1检测患者因新冠病毒而产生的特异蛋白质新型冠状病毒IgM抗体快速检测试剂盒，该试剂盒采用间接法检测人新型冠状病毒IgM抗体，仅需采取一滴血就有望在15分钟内肉眼观察获得检测结果，且患者的血浆稀释500至1 000倍后，仍能检测出阳性条带。其实质为利用抗原抗体杂交技术，但是无论如何，现在抗体检测还不能完全替代核酸检测。2检测新冠病毒的核酸新型冠状病毒是一种仅含有RNA的病毒，病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其他病原体的标志物。检测原理：核酸检测盒包括：逆转录酶试剂、病毒核酸标准试剂、热稳定DNA聚合酶、引物序列、特异性的荧光DNA探针(带荧光的一段特异性的新冠病毒的核酸
2、序列，这个是最关键的，如果特异性不强或者是病毒在这一段发生变异，则很可能会判定为阴性，影响结果)等。目前采用RTPCR技术(逆转录荧光PCR技术)。(1)先从样本中提取RNA，RNA中可能有新冠病毒的RNA，同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。(2)先通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA。因为新冠病毒中的核酸为RNA，而RNA极易降解，为了防止我们检测的物质在检测过程中降解，我们把它转换为更稳定的DNA。(3)检测扩增出的PCR产物，即DNA片段。我们扩增的病毒DNA片段能够发出荧光而被仪器检测到。这些扩增出的供我们检测的产物的多少，很大程度上取决于样本中目标R
3、NA量的多少。而目标RNA量的多少又与样本中病毒的多少相关。下图显示了相关原理：在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。跟踪训练1(2022潍坊期末考试)“防疫攻坚
4、进行时，不再是说走就走的旅行”，为控制跨境传播，我国驻多国大使馆先后发布通知，赴华人员需要提供新冠病毒核酸检测及血清抗体检测的双阴性证明。目前，PCR技术(荧光PCR法)是病毒核酸检测的主流方法，是新冠病毒检测试剂盒采用最多的技术。IgM/IgG联合检测(胶体金法)是新冠抗体检测试剂盒主要采用的技术。请分析回答下列问题：(1)新冠病毒是RNA病毒，所以需对样本进行_处理后再PCR扩增，如果样本存在目标病原体，则会因为_的特异性，扩增出相应的目标基因片段，由此判断是否为阳性。(2)荧光PCR法，又称qPCR法，是指在反应体系中加入_，通过专门仪器实现实时荧光检测，以_来测定PCR循环后产物中核酸
5、水平。(3)IgM和IgG均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的抗体。IgM/IgG检测试剂盒的原理是_，通过检测人体内相应抗体间接证明是否感染。被病毒感染后，机体会产生一系列的变化来抵御这种入侵，其中IgM和IgG的含量会发生如图所示变化。通过对COVID19患者研究发现，病毒侵入人体后，大约需要57天产生IgM抗体，IgG抗体在感染后1015天时产生。通过检测外周血中IgM和IgG，不仅可以鉴别是否感染，还可以辨别检测者是近期感染或者是既往感染。当核酸检测结果为阳性，IgM()IgG()时，可判断检测者为_；已治愈的患者检测结果应为_。答案(1)逆转录引物(2)荧光物质
6、荧光强度(3)抗原与抗体特异性结合近期感染核酸检测结果为阴性，IgM()IgG()解析(1)基因工程中，目的基因的获取方法有两种，一种是直接从基因文库中获取，另外一种是人工合成，人工合成的方法必须已知目的基因序列，方法有两种，DNA合成仪合成和PCR技术合成。PCR是扩增DNA的一种方法，如果是RNA病毒，首先要转化成DNA，也就是逆转录；利用PCR技术进行新冠病毒核酸检测时，如果样本存在目标病原体，就会因为引物的特异性，扩增出相应的目标基因片段，由此判断是否为阳性。(2)荧光PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，通过专门仪器实现实时荧光检测，以荧光强度的高低
7、来判断PCR循环后产物中的核酸水平。(3)新型冠状病毒基因编码多个结构蛋白，这些蛋白包括多个抗原位点，利用抗原与抗体特异性结合的原理，可通过抗体检测抗原的存在，从而直接证明样本中含有新型冠状病毒，间接证明机体感染与否。2“实时荧光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在12 h内即可得到检测结果。TaqMan探针是实时荧光定量RTPCR技术中一种常用探针(如图1)，其5端连接荧光基团(R)，3端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中，当Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号
8、的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答：(1)结合图1和图2分析，“荧光RTPCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有_酶、_酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2、缓冲剂等。这种分子层面的荧光RTPCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的_、_有关。(2)根据TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据_。新冠病毒(2019nCoV)是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起SARS的冠状病毒碱基序列有79.5%的相似性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计TaqMan探针时应筛选出2019nCoV特有序列，以避免_(填“假阴性”或“假阳性
9、”)的出现。(3)根据图1和图2，Taq DNA聚合酶除了能催化DNA子链的延伸，还能_。(4)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与_、_有关。在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，增加了检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如下图)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中_等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。(5)虽然荧光RTPCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析，“假阴性”的可能原因有_(填字母)。a通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足b在样本运输、检测中出现了损坏和污染c病毒相应关键序列发生了基因突变答案(1)逆转录TaqDNA聚合引物TaqMan探针(2)新冠病毒RNA内部的一段序列(或新冠病毒RNA逆转录形成的DNA的部分序列)假阳性(3)催化RNA(TaqMan探针)的水解(4)扩增次数样品中病毒初始数量(或病毒样品模板RNA含量)原料、引物和探针数量(或Taq DNA聚合酶活性)(5)abc
