1、解惑练5CRISPR/Cas9技术1CRISPR/Cas9技术敲除掉部分基因原理(1)CRISPR/Cas9是细菌的一种后天免疫防御机制CRISPR序列示意图如下(其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列)，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。(2)病毒或外源质粒上存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM(原间隔序列临近基序)。(3)当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序
2、列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。(4)当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPRRNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。2CRISPR/Cas9技术的运用和发展(1)具体运用
3、如下图所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(指导RNA)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。(2)CRISPR/Cas9基因魔剪：当研究人员要用基因魔剪来编辑一个基因组时，他们会人工构建一个指导RNA，它与将要被切割的DNA代码相匹配。魔剪蛋白Cas9与指导RNA形成复合物，将魔剪带到基因组中将要进行切割的地方。(3)原始的C
4、RISPRCas9会由于RNA定位偏差而出现脱靶效应，现在通过改进，可以大幅降低脱靶效应。同时还发现了一些新的系统，除了最开始的Cas9，后面又找到了Cas12的一系列酶，机理上有一定不同，但还是用以切割DNA；还有Cas13则用于切割RNA。基于Cas12和Cas13的开发以及机制研究，又发展出了新的工具用于快速检测病毒，效率可以达到几分钟检测一个样品，并且用到了现在的新冠病毒检测中。跟踪训练1CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，受此机制启发，科学家们研发了CRISPR/Cas9基因编辑技术，这是一种对靶向基因进
5、行特定DNA修饰的技术，其原理是由一个向导RNA分子引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的任一目标位点进行切割(见下图)。请据图分析回答下列问题：(1)CRISPR/Cas9基因编辑复合体中Cas9蛋白是由相应基因指导，在细胞的_中合成的，其工作原理是特异性地切断目标DNA的_(填具体部位)；向导RNA中的识别序列与目标DNA的识别遵循_原则，该复合体中，决定其在DNA上切割位点的是_。(2)中国科学家从肺癌患者血液中提取某种细胞，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术加入一个帮助这种细胞定向清除肿瘤的新基因序列，然后
6、再把这些细胞注入患者的血液，以达到杀死癌细胞的目的。这些细胞应该是人体的_，这种治疗方法属于_(填“体内”或“体外”)基因治疗。(3)分析上述信息可知，CRISPR/Cas9基因编辑技术与早期基因工程相比最明显的优势是_。答案(1)核糖体磷酸二酯键碱基互补配对向导RNA中的识别序列(2)T淋巴细胞体外(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可人为地选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强解析(3)与早期基因工程相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术可以对特定位点进行编辑，故其最明显的优势是可人为地选择DNA上的目标位点进行切割，目的性更强。2(2022湖南高三模拟)CRISPR/Cas9基
7、因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，对该研究有突出贡献的科学家被授予2020年诺贝尔化学奖。其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点进行切割，从而达到基因定点敲除、敲入、突变的目的。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(如图所示)。请据图分析回答下列问题：(1)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9借助向导RNA对目标DNA分子进行精准定位，依赖于_；Cas9蛋白能对目标位点进行准确切
8、割，是因为_，由此可见，Cas9在功能上属于_酶。(2)在使用Cas9对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和_(填“相同”或“不同”)的向导RNA进行基因编辑。在设计向导RNA识别序列时，若目标DNA的链切点附近序列为GAATCTCCA，则向导RNA上识别序列为_。(3)已知玉米中赖氨酸含量较低，原因是与赖氨酸合成过程中的两个关键酶天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度影响较大。当赖氨酸浓度达到一定量时就影响这两种酶的活性，从而使赖氨酸含量很难提高，不能满足需求。现使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶基因进行改造，首先需要构
9、建由启动子、_(目的基因)、标记基因、终止子等组成的基因表达载体，然后使用_法导入玉米细胞，完成转化后CRISPR/Cas9系统可在玉米体细胞中特定的基因位点改写遗传信息，再经_技术培育成赖氨酸高产的玉米植株。答案(1)向导RNA识别序列与目标DNA之间的碱基互补配对Cas9蛋白能识别特定核苷酸序列并在特定位点断开磷酸二酯键(Cas9蛋白具有专一性)限制性内切核酸(2)不同GAAUCUCCA(3)Cas9蛋白基因和sgRNA基因农杆菌转化植物组织培养解析(1)CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，能准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助向导RNA与目标DNA进行精确定位的原因在于向导RNA上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现向导RNA与目标DNA分子特定序列的特定识别，进而定位；对目标位点的切割则依赖于Cas9的专一识别，Cas9蛋白能识别特定核苷酸序列并在特定位点剪切特定的碱基序列，使磷酸二酯键断裂。由此可见，Cas9在功能上属于限制性内切核酸酶。