1、课题3血红蛋白的提取和分离学习目标：1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。(重点)2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程与方法。(难点)1蛋白质分离的原理和方法(1)分离蛋白质的原理蛋白质特性的差异(2)分离蛋白质的方法凝胶色谱法：概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶原理：相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。电泳：概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁
2、移的过程。原理：a许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。b在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。c电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3)缓冲溶液作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。配制：由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。2蛋白质提取和分离的实验操作(1)样
3、品处理红细胞的洗涤：目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。方法：血红蛋白的释放：目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。过程：分离血红蛋白溶液：将混合液离心将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层于分液漏斗中静置片刻分离出下层的红色透明液体。(2)粗分离透析过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。目的：将相对分子质量较小(填“大”或“小”)的杂质除去。原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。(3)纯化凝胶色谱操作凝胶色谱柱的制作：取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两
4、端需用砂纸磨平。柱底制作：打孔挖凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。柱顶制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。凝胶色谱柱的装填：色谱柱固定于支架上。干凝胶的计算和称量。溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。装填：打开下端出口，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20 mmol/L的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12 h。样品的加入和洗脱：调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：用量为1 mL样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱收集：待红色
5、的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集(4)纯度鉴定在鉴定的方法中，使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。1判断对错(1)可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质。()(2)用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质。()(3)透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜。()(4)凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法。()提示：(1)猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，不能从其红细胞中提取出DNA。(2)(3)(4)2下列各项中，不是电泳使样品中各种分子分离的原因的是()A带电性质差异B
6、分子的大小C分子的形状D分子的变性温度D电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，而迁移速度与分子的变性温度无关。3蛋白质提取和分离的一般步骤是()样品处理凝胶色谱操作粗分离SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化纯度鉴定ABCDB蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。凝胶色谱操作及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。蛋白质提取与分离的原理和方法合作交流1凝胶色谱法分离过程是怎样的？提示：蛋白质混合物上柱洗脱大分子流动快、小分子流动慢先收集大分子后收集小分子。2凝胶的成分是什么？凝胶有何特点？提示：
7、成分：大多数是多糖类化合物构成的一些微小的多孔球体，如葡聚糖或琼脂糖。特点：小球体内部有许多贯穿的通道，可以分离不同相对分子质量的蛋白质。归纳总结 1蛋白质分离的依据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。2蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径运动方式垂直向下运动无规则的扩散运动运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱顺序先从凝胶柱中洗脱出来后从凝胶柱中洗脱出来3.电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在
8、电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，使其迁移速率完全取决于分子的大小典题通关如图表示对某蛋白质溶液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是()A蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动B蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少C蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度取决于其相对分子质量的大小D电泳结果表明溶液中的蛋白质可能有两种，也可能只有一种B蛋白质的氨基与羧
9、基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带的电荷，故其移动速度与本身所带电荷多少无关，而由其分子大小决定。SDS可使蛋白质变性形成肽链，故结果所示可能是一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。(1)图中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什么？(2)除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法还有哪种？提示：(1)负电荷，因为它们移向了阳极一端。(2)琼脂糖凝胶电泳法。1利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是()A相对分子质量大的B溶解度高的C相对分子质量小的D所带电荷多的A相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部
10、通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。2下列有关缓冲溶液的说法，不正确的是()A缓冲溶液能够抵制外界任何酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成C调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液D生物体内的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的A缓冲溶液通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液。在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，超过一定范围，缓冲溶液就起不到这样的作用了。血红蛋白的
11、提取和分离实验操作合作交流1洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。2在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？提示：(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。3血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简
12、化了实验操作。归纳总结 1样品处理、分离与纯化的目的不同目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的蛋白质2.结果分析与评价项目分析血液样品的处理分层明显样品处理完成；分层不明显的原因：a.洗涤次数少，未能除去血浆蛋白；b.离心速度过高或时间过长凝胶色谱柱的装填凝胶颗粒填充紧密、均匀，无气泡装填成功血红蛋白的分离血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出分离成功；血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽分离效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关典题通关如图
13、是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是()A首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质B图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质C用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集D图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动B用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。(1)在凝
14、胶色谱操作前，获得的血红蛋白溶液中的杂质应尽量除去，哪些操作是为了达到这一目的？(2)丙图中决定蛋白质运动方向和速度的因素有哪些？提示：(1)用生理盐水对红细胞进行洗涤，目的是洗去红细胞表面上的杂蛋白；离心分层，目的是除去一些脂溶性物质；透析，目的是除去一些小分子的杂质。(2)蛋白质所带电荷的性质、分子的大小和形态等。在蛋白质的提取和分离中，关于对样品的处理，分析正确的是()A洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过慢，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C洗涤过程选用质量分数为0.1%的NaCl溶液D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质D本题主要考查了血红
15、蛋白提取和分离中的样品处理。洗涤红细胞的目的主要是除去血浆中的蛋白质；洗涤时离心速度过快，时间过长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程用到的是质量分数为0.9%的NaCl溶液。故正确答案为D。课堂小结知 识 网 络 构 建核 心 语 句 归 纳1.凝胶色谱法分离蛋白质取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的路程较短，移动速度快；相对分子质量较小的，路程较长，移动速度慢。2.缓冲液能在一定范围内抵制外界酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。3.电泳时，带电分子会向其所带电荷相反的电极移动。4.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。5.在电泳中，待分
16、离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状都会影响分子的迁移速度。6.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。1下列关于样品的加入和洗脱的操作不正确的是()A加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐。2相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的分离过程可表示为下列哪一项()B相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部
17、，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶颗粒内部，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量较小的蛋白质后流出。3凝胶柱制作的顺序一般是()橡皮塞打孔挖凹穴装玻璃管盖尼龙网盖尼龙纱将橡皮塞插入玻璃管接尼龙管、装螺旋夹柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞ABCDB凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管选择合适的橡皮塞打孔挖凹穴盖尼龙网盖尼龙纱将橡皮塞插到玻璃管接尼龙管装螺旋夹柱顶插入安装玻璃管的橡皮管。4PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异地扩增任何要求的目的基因或者DNA
18、分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：(1)PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是_。(2)在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段外，还需要_、_和_等条件。(3)某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增3次(复制3次)至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是_和_个。解析(1)DNA分子具有双螺旋结构，扩增时DNA分子双链之间的氢键断裂，两条链彼此分开，各自吸收细胞内的脱氧核苷酸，按照碱基互补配对原则合成一条新链，然后新旧链联系起来，各自形成一个完整的DNA分子。(2)PCR反应的条件：稳定的缓冲液环境，DNA模板；分别与模板DNA 2条模板链相结合的2种引物；A、T、G、C 4种脱氧核苷酸；耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶；能严格控制温度变化的温控设备。(3)在DNA片段中，有腺嘌呤35个，可求出鸟嘌呤为45个，DNA分子扩增3次需要腺嘌呤脱氧核苷酸35(231)245个，鸟嘌呤脱氧核苷酸45(231)315个。答案(1)DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对(2)4种脱氧核苷酸引物耐热的DNA聚合酶(3)245315