1、课题1微生物的实验室培养学习目标：1.知道培养基的种类、营养要素及配制原则。(重点)2.掌握消毒、灭菌的原理和方法。(重点)3.学会配制培养基和纯化大肠杆菌的方法。(重、难点)1培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)种类：按物理性质分(3)营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(如维生素、氨基酸和碱基等)以及氧气的要求。2无菌技术(1)无菌技术的目的是防止外来杂菌的入侵。主要内容包括：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微
2、生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。(2)消毒和灭菌：消毒灭菌概念使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌适用对象操作空间、操作者双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等3.大肠杆菌的纯化培养(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基培养基应采用高压蒸汽灭菌；倒平板时要待培养基冷却至50_左
3、右时，在酒精灯火焰附近进行，等平板冷凝后将平板倒置。(2)纯化大肠杆菌纯化培养的原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种。纯化培养方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上纯化大肠杆菌，最常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37_恒温箱中，培养12 h和24 h后，分别记录观察。菌种保存：临时保藏法甘油管藏法适用对
4、象频繁使用的菌种长期保存的菌种培养基类型固体斜面培养基液体培养基温度4 20 方法菌落长成后放入冰箱中保存，以后每36个月将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后放在冷冻箱内保存缺点菌种易被污染或产生变异1判断对错(1)高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖。()(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。()(3)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。()提示：(1)在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的压力降到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。(2)倒平板时，
5、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。(3)接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。2制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是()A计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D计算、称量、灭菌、溶化、倒平板C制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。培养基及无菌技术合作交流1虽然各种培养基的具体配方不同，但是一般都含有哪些成分？提示：虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。另外，还必须满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的
6、要求。2对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。3无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。归纳总结 1培养基的配制原则(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾磷酸二氢钾。2培养基的成分及功能营养物质作用功能主要来源碳源能为微生物代谢提供碳元素构成生物体
7、的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等氮源能为微生物的代谢提供氮元素合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子是生长必不可少的酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水是生命活动所必需的不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定外界摄入无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂无机化合物3.几种常用灭菌和消毒方法的比较灭菌和消毒种类主要方法应用范围巴氏消
8、毒法7075 煮30 min或80 煮15 min牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等干热灭菌干热灭菌箱160170 加热12 h玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品高压蒸汽灭菌100 kPa、121 维持1530 min培养基及多种器材、物品煮沸消毒法100 煮沸56 min家庭餐具等生活用品的消毒紫外线消毒30 W紫外灯照射30 min接种室空气化学药物消毒用体积分数为70%75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等用于皮肤、伤口、动植物组织表面
9、消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒特别提醒：(1)用酒精消毒时，体积分数为70%的酒精消毒效果最好，原因是浓度过高，菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌力减弱。(2)接种室、接种箱和超净工作台在使用前，可以用紫外线照射以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。(3)芽孢是某些细菌生长到一定阶段，在细胞内形成的休眠体。孢子是某些微生物的繁殖体。(4)消毒和灭菌都是通过一定的理化手段，使病原体的蛋白质或核酸变性，失去活性。只是作用的条件不同，抑菌杀菌的程度不同。典题通关下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴
10、别培养基的依次是()原料蛋白胨/g10101010乳糖/g5555蔗糖/g5555KH2PO4/g2222伊红/g0.4美蓝/g0.065琼脂/g1020NaCl/g20蒸馏水/mL1 0001 0001 0001 000AB C DD高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。(1)表格中的蛋白胨主要为微生物提供何种营养成分？(2)乳糖和蔗糖在培养基中的作用是什么？(3)如果用培养基培养某种自养微生物，则该配方中的
11、哪种物质可以去除？提示：(1)主要为微生物提供碳源、氮源和维生素。(2)可以为微生物提供碳源和能源。(3)乳糖和蔗糖。1关于灭菌和消毒的不正确的理解是()A灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B消毒和灭菌实质上是相同的C接种环用灼烧的方法灭菌D常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌等B消毒是指用温和的理化方法杀死体表或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，灭菌则是用强烈的理化因素杀死体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。2空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：配制培养基(成分：牛
12、肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；制作无菌平板；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；将各组平板置于37 恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。(2)步骤中，实验组的操作是_。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。解析(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实
13、验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。答案(1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染纯化大肠杆菌合作交流1接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？提示：(1)划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。(2)划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。2在倒平板时为何要在酒精灯的火焰旁进行？提示：酒精灯的火焰旁是无菌区域，
14、在酒精灯的火焰旁操作，可以避免周围环境中微生物的污染。3接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果有菌落生长，说明了什么？提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。归纳总结 1平板划线法(1)操作步骤(2)注意事项第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。在做第二次以及其后的划线操作时，总是从
15、上一次划线的末端开始划线，这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。划线时最后一区域不要与第一区域相连。划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。2稀释涂布平板法(1)操作步骤系列稀释操作：a将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。b用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。c从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复b步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。涂布平板操作：(2)注意事项每支试管及其中的9 mL
16、水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰12 cm处。涂布器用体积分数为70%酒精消毒，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体。3实验结果分析与评价(1)未接种的培养基表面若有菌落生长，说明培养基被污染；若无，则说明未被污染。(2)在接种大肠杆菌的培养基上可观察到独立的菌落。有光滑型菌落，菌落边缘整齐，表面有光泽，湿润、光滑、呈灰色；也有粗糙型菌落，菌落扁平、干涩、边缘不整齐；还有黏液型菌落，为含荚膜菌的菌落。(3)培养12
17、 h和24 h，菌落大小不同，培养24 h，菌落大，灰色深，光泽度强。(4)若在培养基中观察到不同形态的菌落，原因可能是菌液不纯、混入其他杂菌或在实验操作过程中被杂菌污染。特别提醒：平板划线法和稀释涂布平板法的比较(1)单细胞菌落的获得：利用平板划线法接种时，单细胞菌落从后划线的区域挑取；利用稀释涂布平板法接种时，只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落。(2)两种接种方法的应用：两种方法都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的；稀释涂布平板法还能对微生物进行计数，而平板划线法不能用于微生物的计数。典题通关下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法操作结
18、果。下列叙述中，错误的是()A甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液B对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成C乙中培养皿中所得的菌落都符合要求D乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端技巧点拨(1)对菌液进行稀释时，菌液中的菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要越高，菌体的浓度低时，则稀释的倍数不必太高。(2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要冷却后才能接触菌种。(3)平板划线法的多次划线中，菌体越来越少，即不同划线处的菌体数目不同，所以形成的菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成的。C灼烧后的接种环如果没有冷却就接触菌种，会将菌体
19、杀死，A正确；稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确；平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。(1)两种接种方法中，如果操作均正确无误，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数而平板划线法不能，请简述原因。(2)稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？提示：(1)只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平板法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成
20、的，即一个肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落，可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。而平板划线法中除了最后一次划线末端处的菌落是由单一的细菌繁殖而成的，其他每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适合用于细菌的计数。(2)决定稀释倍数及划线次数的因素是菌液的浓度，如果菌液的浓度较高则需要高倍数的稀释，所划线次数也要较多，否则就可以低倍稀释或减少划线次数。1平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。下列相关叙述中错误的是()A平板划线法要求要连续多划几次，且除了第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的终点B除了第一次划线需要将接种环灼烧灭菌外
21、，以后的划线可以不用灭菌即可划线C如果菌液本来浓度不高，则可以适当降低稀释倍数D充分稀释和连续划线的目的都是为了使形成的菌落是由单一的细菌繁殖而成B平板划线法需要连续划线的目的就是使得细菌的浓度降低，所以除了第一次划线外，以后的每次划线的起点是上一次划线的终点，A正确；为了防止被杂菌污染，每一次划线前都要将接种环进行灼烧灭菌，B错误；稀释倍数要随菌液的浓度而定，如果菌液的浓度太大，则需要更高的稀释倍数，否则就可以适当降低稀释的倍数，C正确；稀释涂布平板法中的充分稀释及平板划线法中的连续划线，目的都是为了保证菌落是由单一的细菌繁殖而成，D正确。2为了保存菌种的纯净需要进行菌种的保藏，下列有关叙述
22、不正确的是()A对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法B临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上C临时保藏菌种容易被污染或发生变异D对于需要长期保存的菌种，可以采用低温4 保藏的方法D对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在3 mL的甘油瓶中加入1 mL甘油后灭菌，将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，放在20 的冷冻箱中保存。课堂小结知 识 网 络 构 建核 心 语 句 归 纳1.培养基的成分一般包括水、碳源、氮源、无机盐，除此之外，还应满足微生物对pH、特殊营养物质及氧气的需求。2获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。3消毒和灭菌的区别是后者更彻底，将物体表面及内部所有微
23、生物包括芽孢、孢子全部杀死。4微生物培养中常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，前者操作简单，后者可用于微生物计数。5固体培养基的配制过程：计算称量溶化灭菌倒平板。1下列说法正确的是()A为微生物的生长繁殖提供营养物质的是固体培养基B培养基只有两类：液体培养基和固体培养基C固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基D微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的菌落D培养基可以按物理性质分类，也可以根据化学成分或用途进行分类，所有类型的培养基都可以为微生物的生长繁殖提供营养物质，故A、B错误；固体培养基和液体培养基的区别在于是否加入凝固剂(如琼脂)，故C错误。2在培养基的配制过程中，具有如
24、下步骤，其正确顺序为()溶化调pH加棉塞包扎分装称量ABCDB上述步骤中，培养基的配制顺序为称量溶化调pH分装加棉塞包扎。3无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是()A对培养操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌B对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌C为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行D实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触A灭菌是采用强烈的理化因素对用于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基进行处理，使物体内外一切微生物，包括芽孢和孢子都被杀死；实验操作者的衣着和手以及操作空间只能进行消毒。4下列关于平板划线操作的叙述正确的是()A使用已灭菌的接
25、种环、培养皿，在操作过程中不再灭菌B打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞C打开培养皿盖，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可D最后将平板倒置，放在培养箱中D在平板划线操作中，已灭过菌的接种环在每次划线后都必须用灼烧灭菌法再次灭菌，以防杂菌污染；盛有菌种的试管在打开后或重新塞棉塞前，都需将试管口通过火焰进行灼烧灭菌；划线过程中，培养皿盖应打开一条缝隙，进行接种，接种完毕后，迅速盖上培养皿盖，以防杂菌污染；将平板放入培养箱培养时需倒置，主要是为了防止培养皿盖上的水珠落在培养基上，造成污染。故选D。5(2019全国卷)回答下列与细菌培养相关的问题。(1)在细
26、菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是_。硝化细菌在没有碳源的培养基上_(填“能够”或“不能”)生长，原因是_。(2)用平板培养细菌时一般需要将平板_(填“倒置”或“正置”)。(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是_。(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过_处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。答案(1)蛋白胨不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同能够硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源(2)倒置(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征(4)灭菌
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