1、考点加强课6 限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定纵观近年高考，选修3基因工程几乎是必考内容，是高频考点，考查内容包括基因工程的原理、基因工程的工具、基因工程的基本步骤及基因工程的应用等，然而，相关内容考查时常常涉及限制酶的选择及目的基因的检测与鉴定等，针对选择何种限制酶的问题，应为难点，区分度高，失分严重，为此，为总结规律，归纳方法，特设置本课。【例证】 （2016全国卷，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的）。根据基因工程的有关知识，回答下列
2、问题：（1）经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是_。（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有，不能表达的原因是_。图（c）（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。慧眼识图获取信息（1）三种限制酶切割结果分析（2）表达载体与重组DNA分子分析答案（1）Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下
3、游，二者的目的基因均不能被转录（3）EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶1限制酶的选择原则（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于完全破坏“标记基因”。（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，
4、以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst 因其会破坏标记基因而不宜选择。所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hind会破坏启动子，EcoR会破坏终止子，而Nde、Xba及BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。（3）参加Ti质粒的TDNA片段选择限制酶若质粒上标出TDNA片段，则所
5、选限制酶切点应位于TDNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到TDNA片段上因为Ti质粒的TDNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba 和Sac （两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）2.目的基因的检测与鉴定（1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞
6、后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。（2）使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA。
7、（3）采用“抗原抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。（4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。1.（2017北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（）A.用限制性核酸内切酶EcoR I和连接酶构建重组质粒B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞C.在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染
8、色体上解析图2中质粒中的抗性基因为潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C错误。答案C2.（2017广东省惠州市模拟）长期以来香蕉生产遭受病害的严重威胁，制约了其发展。目前，随着转基因抗病香蕉基因工程技术的日趋成熟，为培育抗病香蕉品种开辟了新途径。转基因抗病香蕉的培育过程如图所示，质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答：（1）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶，对进行切割。（2）培养基中的卡那霉素会抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有，作为标记基因。（3）能使抗病基因在香
9、蕉细胞中特异性表达的调控序列是（填字母序号）。A.启动子 B.终止子C.复制原点 D.标记基因（4）将目的基因导入植物细胞常用方法有多种，图中所示方法为。（5）欲检测目的基因是否表达成功，可采用的技术是。（6）利用组织培养技术将导入抗病基因的香蕉组织细胞培育成转基因植株，香蕉组织培养的培养基中除了含有一定的营养物质外还必须含有等植物激素，它们会在（填图中标号）阶段发挥作用，同时（填图中标号）阶段还需要给予一定光照。解析（1）从图中可看出，只有Pst、EcoR两种酶能保持抗病基因结构的完整性，所以构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶Pst、EcoR两种酶，对含抗病基因的DNA和质粒进行切割
10、。（2）卡那霉素能抑制香蕉愈伤组织细胞的生长，欲利用该培养基筛选已导入抗病基因的香蕉细胞，应使基因表达载体A中含有卡那霉素抗性基因，以此作为标记基因。（3）启动子和终止子能启动目的基因的转录与终止，是使抗病基因在香蕉细胞中特异性表达的调控序列。（4）将目的基因导入植物细胞的方法有：农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。图中采用的是最常用的农杆菌转化法。（5）检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，采用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA，采用分子杂交技术；检测目的基因是否表达成功产生相应的蛋白质，采用抗原抗体杂交技术。（6）植物组织培养的培养基中需要的植物激素是：生长素和细
11、胞分裂素，在脱分化和再分化中发挥重要作用，在再分化过程中需要给予一定的光照，利于芽的分化。答案（1）Pst、EcoR含抗病基因的DNA和质粒（2）卡那霉素抗性基因（3）AB（4）农杆菌转化法（5）抗原抗体杂交（6）生长素和细胞分裂素和随堂真题&预测1.（2016全国卷，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠
12、杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且和的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有的固体培养基。（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。解析
13、（1）作为运载体必须具备如下特点：能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；含标记基因，以供重组DNA的鉴定和筛选；具一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。（2）在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。（3）噬菌体是病毒，无细胞
14、结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。答案（1）能自我复制、具有标记基因（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素（3）受体细胞2.（2019高考预测）胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程（融合蛋白A、B分别表示半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白）。请回答下列问题：（1）图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是。（2）图1中启动子是酶识别和结合的部
15、位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是_。（3）构建基因表达载体时必需的工具酶有。（4）半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于。（5）溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为_。（6）根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是，理由是_。解析基因表达载体包含启动子、终止子、目的基因和标记基因等。启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点。氨苄青霉素抗性基因可作为标记基因。基因工程使用的工具酶包括限制酶和
16、DNA 连接酶。胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏起来，将无法被蛋白酶所识别，防止被水解。溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，若经溴化氰处理相应融合蛋白能获得完整的A链和B链，表明胰岛素A链、B链上并无溴化氰作用位点，不能将其切断；同理，半乳糖苷酶能被切成“多个肽段”，表明其具有多个切点（即“甲硫氨酸”）。胰岛素分子含有两条链，至少有2个游离氨基分别位于2条肽链的一端，并且R 基团中可能也含有游离的氨基。答案（1）终止子（2）RNA聚合作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来（3）限制酶和DNA连接酶（4）防止胰岛素的A、B 链被菌体内蛋白酶降解（5）半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛
17、素A、B 链中不含甲硫氨酸（6）至少2个两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸R 基团中可能还含有游离的氨基教师独具1.（2017云南名校适应性考试，40）多聚半乳糖醛酸酶（PG）能降解果胶使细胞壁破损，成熟的番茄果实中，PG合成显著增加，能使果实变红变软，但不利于保鲜。利用基因工程减少PG基因的表达，可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上，导入番茄细胞中，得到转基因番茄，具体操作流程如图。据图回答下列问题：（1）提取目的基因若已获取PG的mRNA，可通过获取PG基因。在该基因上游加结构A可确保基因的反向转录，结构A上应具有结合位点。重组质粒转移到大肠杆菌中的目的是_。（2）用
18、含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后，可用含有的培养基进行筛选。培养2448 h后取样，在质量分数为25%的蔗糖溶液中，观察细胞现象来鉴别细胞壁是否再生。（3）由于导入的目的基因能转录出反义RNA，且能与互补结合，因此可抑制PG基因的正常表达。若转基因番茄的保质期比非转基因番茄，则可确定转基因番茄培育成功。（4）获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因，科研人员常采用方法使子代保持转基因番茄的优良性状。解析（1）已获取PG的mRNA，可通过逆转录（反转录）的方法获得目的基因。因转录的产物是mRNA，在转录时需要RNA聚合酶。将重组质粒转移到大肠杆菌中的目的是大量复制目的基因。（2）由图可知
19、，重组质粒中含卡那霉素抗性基因而四环素抗性基因被破坏，故可用含卡那霉素的培养基进行筛选。植物细胞在质量分数为25%的蔗糖溶液中会发生质壁分离现象，所以可以用来鉴别细胞壁是否再生。（3）由以上分析可知，反义RNA与天然PG基因转录的mRNA互补结合，从而抑制翻译过程。若转基因番茄的保质期比非转基因番茄长，则可肯定转基因番茄培育成功。（4）获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因，植物组织培养属于无性繁殖，能保持母本的优良性状，故科研人员常采用植物组织培养方法使子代保持转基因植物的优良性状。答案（1）反转录RNA聚合酶使目的基因随质粒的复制而复制（2）卡那霉素是否发生质壁分离（3）天然PG基因
20、转录的mRNA长（4）无性繁殖（或植物组织培养）2.根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）cDNA文库属于基因文库，其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的反转录产生的cDNA片段，与连接后储存在一个受体菌群中。（2）切割DNA分子的工具是，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开，形成黏性末端或平末端。（3）基因工程中所使用的DNA连接酶有两类。既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端的是DNA连接酶。（4）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是；如果受体细胞是大肠杆菌，需要用处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。解析（1）基因文库包括基因组文库和部分基因文库如c
21、DNA文库。cDNA文库构建的方法是：用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的cDNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中。（2）切割DNA分子的工具是限制酶，它作用的化学键是磷酸二酯键。限制酶切割DNA后形成黏性末端或平末端。（3）基因工程中所使用的DNA连接酶有EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类，前者只可“缝合”黏性末端，后者既可以“缝合”黏性末端，又可以“缝合”平末端。（4）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法；如果受体细胞是大肠杆菌，需要用Ca2处理细胞，使之成为感受态细胞，才能吸收DNA分子。答案（1）部分mRNA载体（2）限制性核酸内切酶磷酸二酯键（
22、3）T4（4）农杆菌转化法Ca2（时间：30分钟满分：100分）1.（2018河南省八市测评，31）科技人员通过基因工程、细胞融合等技术制作工程细胞，并利用工程细胞生产人们所需要的医用蛋白，如用于治疗糖尿病的胰岛素。下面是利用大肠杆菌培育工程菌时用到的质粒、胰岛素基因及相关的限制酶。请回答：表几种限制酶识别序列及其切割位点 （1）能识别人胰岛素的mRNA并催化合成cDNA的酶是；利用PCR技术对cDNA进行扩增所需要的酶是。在基因工程中，限制酶不能识别并切割单链核酸，其具体功能是_。 （2）上表中可切割形成图2胰岛素基因末端的限制酶为；不宜选用Sau3A 限制酶切割质粒的原因是_。酶切后的质粒
23、与胰岛素基因通过（填酶）作用后获得基因表达载体。 （3）基因表达载体导入大肠杆菌前，常用Ca2处理菌体，其目的是_。（4）从大肠杆菌细胞内获得了胰岛素，但其没有降血糖的功能，出现这种现象的原因是_。解析（2）根据胰岛素基因末端序列可知，切割胰岛素基因的限制酶识别和切割的序列为GGATCC，表中的Sau3A可识别切割。分析表格信息可知，Sau3A限制酶可识别并切割Bgl或Bcl限制酶的识别序列，导致质粒中的标记基因均被破坏。答案（1）逆转录酶热稳定DNA聚合酶或Taq酶识别双链DNA的某种特定核苷酸序列并断裂特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键（2）Sau3ASau3A限制酶能识别并切割Bgl和
24、Bcl限制酶的识别序列，导致质粒中的标记基因均被破坏（其他合理答案也可）DNA连接酶（3）提高受体细胞的转化率（其他合理答案也可）（4）大肠杆菌为原核生物，细胞中只有核糖体，没有内质网和高尔基体，不能对肽链进行加工，形成有活性的胰岛素2.（2018中原名校第一次质量考评，30）下面是通过基因工程获得内皮素的主要受体ETA的过程，图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶APa的识别序列为CCCGGG，限制酶Xho的识别序列为CTCGAG。请分析回答下列问题：（1）图中cDNA文库（填“大于”“等于”或“小于”）基因组文库，若要在短时间内获得大量的目的基因片段，可采用PCR技术进行扩增。利用PC
25、R技术扩增目的基因的前提是_。（2）过程中，限制酶Xho切割DNA，形成的目的基因的黏性末端是。用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是_。（3）过程中需要用酶，过程中，要用预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界DNA的感受态。利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是_。解析（1）基因组文库包括了该种生物所有的基因，而部分基因文库只包含一种生物的部分基因，因此cDNA文库小于基因组文库。若要在短时间内获得大量的目的基因片段，可采用PCR技术进行扩增。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列。以便根据这一序列合成引物。（2）过程中利用限制酶Xho切
26、割DNA获得目的基因的过程，限制酶使得DNA的磷酸二酯键断开，形成的黏性末端是。用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是使目的基因定向连接到载体上（或防止自身环化）。（3）过程中需要用DNA连接酶将目的基因与载体组合到一起；过程中，要用Ca2预先处理大肠杆菌，使其处于容易吸收外界DNA的感受态。利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是有利于检测内皮素受体ETA基因能否表达及表达量。答案（1）小于要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物（2）AGCT（或）使目的基因定向连接到载体上（或防止自身环化）（3）DNA连接Ca2（或氯化钙溶液）有利于检测内皮素受体
27、ETA基因能否表达及表达量3.（2017郑州二测，38）Bt基因即是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）基因，因其表达产物Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。下图为培育转Bt基因苗的基本操作过程。（1）Bt基因可从构建的Bt基因组文库中获取，也可以从其cDNA文库中获取，从前者获取的基因（填“含有”或“不含有”）启动子。若利用PCR技术从cDNA文库中获取Bt基因（基因序列未知），需根据Bt蛋白氨基酸序列设计引物，引物的序列可以有多种，原因是_。在PCR体系中需加入其中的（填“全部”或“任意1种”或“其中2种”）引物。若Bt
28、基因序列已知，则引物的序列通常为种。 （2）在构建基因表达载体的过程中，为了方便筛选含有目的基因的细胞，作为运载体的Ti质粒应含有基因，其中是驱动基因转录的酶识别和结合的位点，而能帮助目的基因整合到宿主细胞染色体上的序列称为。图示将目的基因导入受体细胞的方法是_。 （3）步骤中产生的细胞团称为，步骤和V过程要注意控制培养基中的浓度比例，以便获得幼苗。答案（1）含有一种氨基酸可能有多种密码子，对应引物DNA碱基序列就会有多种全部 2（2）标记（抗性）启动子TDNA（可转移DNA）农杆菌转化法 （3）愈伤组织生长素与细胞分裂素4.（2018河南名校一联，38）胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。现利用基
29、因工程技术让大肠杆菌生产人胰岛素，下图为大肠杆菌质粒，请据图作答。补充说明：Hind、BamH、EcoR 是限制酶切位点tetR、ampR是抗生素抗性基因（1）获取目的基因时，应从人的文库（基因组/cDNA）中获取，这样做的原因为。获取后不能直接对目的基因酶切，因为 ，因此需要在目的基因两端添加。（2）天然人胰岛素不耐储存，可使用蛋白质工程对蛋白质进行改造。蛋白质工程的基本途径为设计预期蛋白质结构找到相对应的脱氧核苷酸序列。答案（1）cDNAcDNA中无内含子序列，能够在大肠杆菌中表达正确蛋白质cDNA中只有编码氨基酸的序列，直接酶切会导致基因结构改变BamH 和EcoR I的识别位点 （2）预期蛋白质功能推测应有的氨基酸序列
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