1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数学习目标：1.明确用培养基对微生物进行选择的原理。(重点)2.学会统计微生物数量的方法。(重点)3.能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。(难点)1研究思路(1)筛选菌株的思路自然界中目的菌株的筛选依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。实验室中目的菌株的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。方法：利用选择培养基分离。a选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑
2、制其他种类微生物生长的培养基。b实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。(2)统计菌落数目常用方法：稀释涂布平板法。原理计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M。C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。M：代表稀释倍数。注意事项a为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取平均值。b统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。c设置对照：主要目的是排除实验组中非测
3、试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。其他方法：利用显微镜直接计数。2实验设计及操作提示(1)实验设计 土壤取样从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约38 cm的土壤层取样。样品的稀释稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30300之间，便于计数。微生物的培养与观察a培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。b观察：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。(2)操作提示无菌操作取土样的用具在使用前都需要灭菌。应在火焰旁称取土壤，并在火焰附
4、近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。(3)菌种鉴定原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。1判断对错(1)因为土壤中各类微生物的数量不同，所以，为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离。()(2)测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围不同
5、。()(3)如果得到了两个或两个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。()(4)牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显少于选择培养基上的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌种。()提示：(1)(2)(3)(4)牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显大于选择培养基上的菌落数目，才说明选择培养基具有筛选作用。2产生每个标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是()A一个细菌，液体培养基B许多细菌，液体培养基C一个细菌，固体培养基D许多细菌，固体培养基C在微生物的培养中产生每个标准菌落的细菌的最初数目是一个细菌，使用的培养基为固体培养基。微生物的筛选与计算合作交流1根据
6、选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。2如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。3稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。归纳总结 1选择培养基的选择作用(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性
7、不同而制备培养基。(2)方法：在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。2统计菌落数目的方法微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：项目直接计数法间接计数法原
8、理利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌主要用具显微镜、细菌计数板培养基计数数据菌体本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，有一定误差计算公式每毫升原液含菌数每小格平均菌体数40010 000稀释倍数每毫升原液含菌数培养基上平均菌落数稀释倍数涂布液体积特别提醒：能在选择培养基上生长的不一定是所需要的目的菌原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一
9、个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步的鉴定。典题通关自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下：制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。为了得到更加准确的结果，应选用_法接种样品。适宜温度下培养。结果分析： (1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是_。A一个平板，统计的菌落数是230B两个平板，统计的菌落数
10、是220和260，取平均值240C三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289D四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_。(3)用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量_(填“多”或“少”)，因为_。技巧点拨(1)因为题中操作的目的是对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是稀释涂布平板法。(2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成30300个菌落。(3)所
11、做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显多于或少于其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应重做或舍弃。解析若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(1)应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。(2)2120.21061.06109(个)。(3)因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。答案稀释涂布平板(1)D(2)1.06109个(3)多当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落(1)如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中操作的数值高还是低？为什么？(2)第(1)小题C项中菌落数为400的平板
12、不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。提示：(1)低，因为稀释倍数太低，则大部分菌落是多个细菌繁殖而成，所以观察到的菌落的数值要低于由单一细菌形成的菌落数值。(2)培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；接种过程中由于操作不当感染了杂菌；取菌液时没有摇晃，所取菌液中细菌个体浓度偏大等。1分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐ABCDC要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。2某
13、同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)()A2.34108个B2.34109个C234个D23.4个B平板上菌落的平均数稀释倍数体积每毫升样品中的菌落数，即234101062.34109(个)。实验设计与操作合作交流1为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的；为确保能从中选择出菌落数在30300之间的平板进行计数。2在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少
14、偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。3统计菌落数目的理论依据是什么？提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。4为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。归纳总结 1实验流程稀释度104105106123平均值123平均值123平均值菌落数/平板菌数/克土壤2实验设计原则(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。(2)设立两种对照组：判断培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基
15、进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。3结果分析与评价内容结果分析有无杂菌污染的判断对照的培养皿中无菌落生长未被杂菌污染培养基中菌落数偏高被杂菌污染菌落形态多样，菌落数偏高培养物中混入其他杂菌选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目选择培养基具有筛选作用样品的稀释操作得到2个或2个以上菌落数目在30300的平板操作成功重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近典题通关尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利
16、用。请回答下列问题：(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成_。(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、_等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是_。(3)一般依据尿素分解菌菌落的_、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数量为_个。上述过程采用的接种方法是_。(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是_。解析(1)分解尿素的细菌中含有脲酶，能将尿素分解。(2)微生物
17、的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，尿素作为氮源。因为只有含有脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度，据此来统计菌落的数目。微生物计数的方法采用稀释涂布平板法接种，1 mL悬液中细菌的数目为(394245)30.11064.2108(个)。(4)单独设置一个灭菌后不接种样液的含培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。答案(1)脲酶 (2)无机盐只有以尿素作为唯一氮源的细菌才能在该培养基上生长 (3)形态、大小4.2108稀释涂布平
18、板法 (4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含培养基)进行培养下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是()A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448 hD确定对照组无菌后，选择菌落数在300 以上的实验组平板进行计数D检测细菌总数，用蒸馏水配制培养基，常用高压蒸汽灭菌法灭菌后，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组放置在适宜条件下培养，在确定对照组无菌后，选择
19、菌落在30300的平板为代表进行计数，D错误。A是培养基的灭菌方法，B设置了一系列对照实验，C是细菌的培养方法，A、B、C三个选项均是正确的。故选D。课堂小结知 识 网 络 构 建核 心 语 句 归 纳1.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。2.设置对照的主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。3.在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。4.为确保结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。5.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素
20、的细菌。6.鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，根据是否变红进行判断。1土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种()A尿素酶B脲酶C蛋白酶D肽酶B能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用。2分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()选项尿素琼脂葡萄糖硝酸盐ABCD注：“”表示加入，“”表示不加。C分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且以尿素作为唯一的氮源，故不能添加硝酸盐。3可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是()A以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C以尿素为唯一氮源
21、的培养基中加入苏丹试剂D以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂A在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，则我们可确定该种细菌能够分解尿素。故正确答案为A。4(2019全国卷)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。回答下列问题。(1)在号培养基中，为微生物提供氮源的是_。、号培养基中为微生物提供碳源的有机物是_。(2)若将土壤悬浮液接种在号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会_，其原因是_。(3)号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是_。(4)假设从号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供_和_。答案(1)牛肉膏、蛋白胨X(2)下降不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖(3)稀释涂布平板法(4)能量合成其他物质的原料