1、5.1 DNA的粗提取与鉴定一、学习目标通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性；理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理，二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。二、学习重点和难点学习重点：DNA的粗提取和鉴定方法。学习难点：DNA的粗提取和鉴定方法。三、学习过程（一）基础知识1DNA的溶解性：思考题1：DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点？对此有什么应用？ 思考题2：利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开？2DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解 ，但对 没有影响。大多数蛋白质不能忍受 的高温，而DNA在 以上才会变性。 能够瓦解细胞膜，但对
2、DNA没有影响。3细胞在 中易吸水而导致细胞膜和细胞核膜的破裂，据此可得到含有核DNA的溶液。4DNA的鉴定：思考题3：依据什么原理来鉴定DNA？（二）实验材料：鸡血细胞液思考题4：生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，他们能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？ （三）实验步骤：1制备鸡血细胞液：在鸡血中加入质量浓度为01g/mL的 溶液，离心处理；2提取鸡血细胞的细胞核物质：向鸡血细胞液中加入蒸馏水，搅拌、过滤；思考题5：加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？3溶解细胞核内的DNA：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态；4析出含DNA的黏稠物：加入蒸馏水，用玻
3、璃棒搅拌；思考题6：此时加入蒸馏水的目的是什么？ 5滤取含DNA的黏稠物：过滤；思考题7：这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？ 6将DNA的黏稠物再溶解：加入2mol/L的氯化钠溶液，搅拌，使DNA呈溶解状态；7过滤含有DNA的氯化钠溶液：过滤；思考题8：这一步骤的目的是什么？ 思考题9：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？8提取含杂质较少的DNA：加入冷却的95%的酒精，搅拌；思考题10：这一步骤的目的是什么？ 思考题11：为什么加入的酒精需要冷却的？ 9DNA的鉴定：取两支试管，各加入0015mol/L的氯化钠溶液5mL，一支加入提取的DNA，两支各加入4mL的二苯胺试剂。混合
4、均匀后置于沸水中加热。思考题12：为什么要设置对照组？实验中能观察到什么现象？ 实验探究1实验原理 提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DN
5、A。DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 2.实验步骤分析（1）破碎细胞，释放DNA鸡血细胞中的DNA与核蛋白结合，位于鸡血细胞的细胞核中，正常情况下是不会释放出来的。为了使DNA从细胞核中释放出来，需要向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA。一般510 mL的鸡血细胞液加入20 mL蒸馏水搅拌5 min。释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质。（2）溶解细胞核内的DNA在浓度较高的N
6、aCl溶液中核蛋白容易解聚，游离出的DNA溶解在溶液中。在溶液中加入两倍体积的浓度为2 mol/L的NaCl溶液，搅拌1 min。注意应沿一个方向搅拌，使DNA充分溶解。（3）DNA的析出将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。本案例选取方案一。加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的终浓度为0.10.2 mol/L。加水过程一般分三次进行，当总加水量为300 mL左右时，DNA已基本析出。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。用34
7、层纱布对DNA稀释液进行过滤，滤去蛋白质，收集DNA的黏稠物。如果采用离心法，效果更好。用4 000 r/min转速的离心机，离心15 min，除去上清液(含有蛋白质)，留下的沉淀物中含有DNA。此时注意观察DNA黏稠物的颜色。.DNA的初步纯化如果提取的DNA量不够多且其中含有较多杂质，或者加入溶液和搅拌等操作过程不规范，都会导致实验现象不明显，常常使制取的DNA粗制品不能显示出DNA的本色白色。为了增进实验效果，需要对DNA粗制品进行简单的提纯。3. 学习成果评价（1）是否提取出了DNA观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，
8、如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。（2）分析DNA中的杂质本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。（3）不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。4. DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶
9、解度升高。5. 制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的原因制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，因为鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA主要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液血浆。6提取DNA的第一步是材料的选取其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DN
10、A的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。7盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。练习1在破碎血细胞时，要先加入20 mL的蒸馏水，其作用是ADNA溶解水中 B血细胞破裂，DNA释放 C稀释血液，防止凝固 D有利于搅拌2以血液为实验材料时，需要向血液中加入（ ），防止血液凝固。A醋酸钠 B龙胆
11、紫 C柠檬酸钠 D醋酸洋红3用过滤的方法得到细胞中的氯化钠溶液后，还要用酒精处理，可以得到较纯化的DNA这是因为：ADNA易溶于酒精，而滤液中某些杂质不易溶于酒精BDNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精CDNA和滤液中其他成分更易溶于酒精DDNA和滤液中其他成分都不溶于酒精4.DNA在下列浓度的NaCl溶液中，溶解度最低的是 A2molLB0.015molL C0.14molLD5molL5.与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均
12、可析出D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L6.洗涤剂能够瓦解 ，但对DNA没有影响。 A.细胞壁 B.细胞膜 C.细胞核 D.细胞质7.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出8.去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的 分解蛋白质。A. 胃蛋白酶 B. 胰蛋白酶 C. 木瓜蛋白酶 D. 肠肽酶9DNA 不溶解于A. NaCl溶液 B. KCl溶液 C. C2H5OH D. MgCl2溶液参考答案练习1B 2C 3. B 4C 5C 6B 7. C 8. A 9. C