1、20.细胞工程(时间：20分钟)1.(2019扬州一模)研究人员利用小鼠的单倍体ES细胞(只有一个染色体组)，成功培育出转基因小鼠，其主要技术流程如图所示，请分析回答下列问题：注：、代表四种限制酶，箭头指向的位置为限制酶的切割位置；Ampr是氨苄青霉素抗性基因，Neor是G418抗性基因。(1)利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物以外，还应含有_；引物应选用下图中的_(填字母)。注：A、B、C、D是引物，箭头是延伸方向。(2)在基因工程操作步骤中，过程称为_。已知氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一
2、定浓度的G418能有效杀死不具有Neor的小鼠细胞，结合上图推测，过程选用的2种限制酶是_(填图中的编号)，处的培养液应添加_(填“氨苄青霉素”或“G418”)。(3)细胞乙与_类似，图中桑椹胚需通过_技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行_处理。解析(1)PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP(包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、引物以外，还应含有耐高温的DNA聚合酶。为了扩增目的基因的片段，根据图示可知需要在引物A和D作用下以目的基因的两条链为模板合成子代目的基因。(2)由图可知，过程是将目的基因和运载体连接形成重组质粒，即基因表达载体的构建过程。
3、重组质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，其作用是有利于筛选出含有目的基因的细胞。根据题意可知，氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neor的小鼠细胞，因此应选择Neor作为标记基因，即质粒上Neor不能用限制酶切割，则过程应选用和两种限制酶，图中处的培养液应添加G418以便于起到筛选的作用。(3)处理形成的细胞乙与受精卵类似，应用早期胚胎培养技术使其发育成桑椹胚。再将桑椹胚通过胚胎移植技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行同期发情处理，以保证供体与受体处于相同或相近的生理状态。答案(1)Taq酶(或耐高温的DNA聚合酶)A和D(2)基因表
4、达载体的构建和G418(3)受精卵胚胎移植同期发情2.(2019苏锡常镇二模)RAS基因是一类与癌症发生有关的基因，该基因突变后被激活，产生了位于细胞特定部位的X蛋白，导致细胞生长和增殖异常，进而引发癌变。科学家研发出一种单克隆抗体RT11i，能靶向结合癌细胞内的X蛋白使其失活，从而抑制癌细胞的增殖。下图表示体外培养条件下，RT11i与经改造的海拉细胞(人宫颈癌细胞)作用的过程，请据图分析回答：(1)从功能上看，RAS基因属于_(填“原癌基因”或填“抑癌基因”)，该基因_(填“存在”或填“不存在”)于正常细胞中。(2)海拉细胞在培养瓶中培养时的特点有_等。(3)通常情况下，抗体由于其大分子性和
5、亲水性而不能穿过活细胞的细胞膜，只能在_中起作用，而RT11i可以通过_(填细胞运输物质方式)进入癌细胞内发挥作用。(4)改造的海拉细胞是通过转基因技术导入GFP110基因形成的，能成功表达相关蛋白，该蛋白片段能与RT11i上的GFP11蛋白片段相结合。而X蛋白也能在药物的处理下发出红色荧光。实验中发现有的海拉细胞内发出了绿色荧光，这一事实表明_。进而发现细胞中红色荧光区域一定伴有绿色荧光，呈现红、绿荧光相伴现象，该事实说明_。(5)实验表明，利用单克隆抗体RT11i有望实现对于RAS突变型癌细胞在_水平上的诊断和靶向的治疗，为人类攻克癌症提供了更加灵敏和精准的途径。解析(1)原癌基因主要负责
6、调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程；抑癌基因主要是阻止细胞不正常增殖。由题意可知RAS基因属于原癌基因。原癌基因与抑癌基因在正常细胞中都存在。(2)正常细胞培养时存在贴壁生长、接触抑制的现象，由于海拉细胞即癌细胞是不受机体控制的恶性增殖细胞，所以培养海拉细胞时的特点是不发生贴壁生长、无接触抑制现象(不死性、无限增殖)。(3)抗体由浆细胞合成并分泌后，在内环境中发挥作用。RT11i是生物大分子，由图可知其进入癌细胞的方式是胞吞。(4)由图可知海拉细胞内的GFP110蛋白片段能与海拉细胞外的GFP11蛋白片段特异性结合，所以当发现有的海拉细胞内发出了绿色荧光，这一事实表明RT11i进入海拉细胞
7、内(并与GFP110蛋白片段结合)。由图可知细胞中红色荧光区域一定伴有绿色荧光，呈现红、绿荧光相伴现象，该事实说明RT11i与X蛋白特异性结合在一起。(5)单克隆抗体RT11i的化学本质是蛋白质，所以填蛋白质分子(或蛋白质)。答案(1)原癌基因存在(2)不发生贴壁生长、无接触抑制现象(不死性、无限增殖)(3)内环境(细胞外液)胞吞(4)RT11i进入海拉细胞内(并与GFP110蛋白片段结合)RT11i与X蛋白特异性结合在一起(5)蛋白质分子(或蛋白质)3.(2019豫南九校质量考评)回答下列问题：.如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR 、BamH 、Sam 的酶
8、切位点，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR 、BamH 、Sam 在内的多种酶的酶切位点。外源DNA插入到ampR或tctR中会导致相应的基因失活(ampR表示氨苄青霉素抗性基因，tctR表示四环素抗性基因)。(1)若将此质粒用Eco1R 酶切割后，与用Eco1R 酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化已用Ca2处理过的大肠杆菌(大肠杆菌本身不含该质粒)，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有_种，其中可同时在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生存的大肠杆菌是_。(2)假如该质粒载体为来自土壤农杆菌
9、的Ti质粒，将其携带的抗虫基因整合到某植物细胞的染色体DNA上，将该细胞通过植物组织培养技术培育成植株后，发现其并无抗虫特性，其可能的原因是_。.某制药厂根据图示的流程图生产治疗甲型流感(H1N1，RNA病毒)的抗体。(3)进行过程a之前，必须对小鼠注射_，使小鼠产生免疫反应。(4)图中b过程称为_，从细胞丙中筛选出杂交瘤细胞需要特定的_。(5)理论上，注射了该抗体的人群不能长期具有对甲型流感的免疫能力，试分析原因_(至少写出两点)。解析.(1)被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。含有质粒载体大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质
10、粒的大肠杆菌都含有氨苄青霉素抗性基因，都可在氨苄青霉素的培养基上生存下来，其中能同时在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌。(2)转基因技术获得的植物没有抗虫特性，可能是抗虫基因没有表达，也有可能是抗虫基因表达的水平极低或产生的抗虫蛋白没有活性。.(3)在单克隆抗体的制备过程中，先要对小鼠进行抗原注射，即用灭活的甲型流感(H1N1)病毒注射，使得小鼠产生免疫反应，提取出已免疫的B细胞，与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。(4)b过程是诱导浆细胞与骨髓瘤细胞融合的过程，若仅考虑细胞间的两两融合，则可形成三种融合细胞，需要用特定的选择培养基进行筛选，从中筛选出杂交瘤细胞。(5
11、)抗体在人体内存留时间较短，且H1N1病毒是RNA病毒，容易发生变异，所以注射了该抗体的人群不能长期具有对甲型流感的免疫能力。答案.(1)3含有质粒载体的(2)抗虫基因并未表达；抗虫基因表达的水平极低或产生的抗虫蛋白没有活性.(3)灭活的甲型流感(H1N1)病毒(4)(动物)细胞融合选择培养基(5)抗体存留时间较短，H1N1是RNA病毒容易发生变异4.(2019江苏七市三模)人参皂甙具有抗肿瘤等作用。科研人员设计如图1所示流程制备人参皂甙Rg3，并研究了过程生物反应器中人参细胞产量、人参皂甙Rg3产量随培养时间的变化，结果如图2。请回答：(1)过程通常需用_酶处理将愈伤组织分散成单个细胞。过程
12、通常采用振荡培养，除有利于增加溶解氧外，还能防止_。(2)由图2可知，生物反应器中人参细胞的数量呈_增长，影响人参皂甙Rg3产量的因素有_和_。图3(3)科研人员研究了人参皂甙Rg3、LeY单克隆抗体(LeY是一种肿瘤相关抗原)以及两者联合使用(联合组)对人子宫内膜移行上皮癌细胞数量增长的影响，结果如图3。药物抑制癌细胞数量增长的途径可能有_、_等。计算细胞数量增长抑制率需测定空白对照组培养相同时间后的细胞数。写出计算细胞数量增长抑制率的公式：_。根据图3结果，可得出的结论是_。解析(1)过程愈伤组织去除细胞壁可分散成单个细胞，去除植物细胞壁通常需用纤维素酶和果胶酶。过程植物细胞培养通常采用振
13、荡培养，除有利于增加溶解氧外，还能防止细胞聚集。(2)通过图2分析可知，随着培养时间的延长，人参细胞数量先增加后稳定；人参皂甙Rg3产量先增加后稳定，故生物反应器中人参细胞的数量呈S型增长，影响人参皂甙Rg3产量的因素有人参细胞数量和培养时间。(3)药物抑制癌细胞数量增长的途径可能有两种：一是抑制癌细胞增殖，二是促进癌细胞凋亡等。通过与对照组对比，癌细胞的数量变化可以知道药物对癌细胞的抑制情况，故计算癌细胞数量增长抑制率的公式：(对照组细胞数实验组细胞数)/对照组细胞数100%。根据图3结果，可得出的结论是人参皂甙Rg3、LeY单克隆抗体均能抑制癌细胞数量的增长，两者联合使用效果更佳。答案(1)纤维素酶和果胶细胞聚集(2)S型人参细胞数量培养时间(3)抑制癌细胞增殖促进癌细胞凋亡(对照组细胞数实验组细胞数)/对照组细胞数100%人参皂甙Rg3、LeY单克隆抗体均能抑制癌细胞数量的增长，两者联合使用效果更佳
