1、三十八基因工程考点一 基因工程的概念及基本工具知识清单1、（2019江苏卷）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：（1）EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为_未端。（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为_的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在_酶作用下，形成重组质粒P3。真题重现答案：(1)平;(2)胸腺嘧啶（T）;DNA连接;解析：(1)基因表达载体的基本结构包括复
2、制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析,P0是载体质粒,其含有的氨苄青霉素抗性基因(ampr)和四环素抗性基因(tetr)都属于标记基因,可以用检测目的基因是否导入受体细胞;EcoRV酶为限制酶,其切割质粒后悔破坏了四环素抗性基因(tetr)。根据题意分析,EcoRV酶识别的序列是-GATATC-,并且两条链都在中间的T与A之间进行切割,因此其切出来的线性载体P1为平末端。(2)据图分析,目的基因两侧为黏性末端,且漏出的碱基为A,则在载体P1的两端需要个加一个碱基T形成具有黏性末端的载体P2,再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。2、(2018
3、全国卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是_，使用这两种酶进行酶切是为了保证_,也是为了保证_。答案：(1)E1和E4;甲的完整;甲与载体正确连接;解析：（1）将甲插入质粒P0时，为了保证甲（L1-GFP融合基因）的完整性，应该选择E1和
4、E4两种酶切割，并且把目的基因插入启动子和终止子之间，从而使其能在受体细胞中表达。模拟考场1、如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法正确的是()(注：Y表示C或T，R表示A或G)A.一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列B.限制酶的切点一定位于识别序列的内部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.限制酶切割后不一定形成黏性末端限制酶BamHEcoRHindKpnSau3ASma识别序列和切割位点GGATCCGAATTCGTYRACGGTACCGATCCCCGGG答案：D解析：由Y表示C或T,R表示A或G，可知限制酶Hind II能识别多种脱氧核昔酸序列，A错误;限制酶的
5、切割位点不一定在识别序列的内部，如Sau3A I,B错误;不同种限制酶切割后形成的黏性末端可能相同，如BamH和Sau3A I,c错误;限制酶切割后不一定都形成黏性末端，也可能形成平末端，如Hind II、Sma I等,D正确。2、下列关于基因工程中有关操作的名词及对应的内容，正确的组合是()A.AB.BC.CD.D供体剪刀针线载体受体A 质粒限制酶DNA连接酶提供目的基因的生物大肠杆菌等B提供目的基因的生物DNA连接酶限制酶质粒大肠杆菌等C提供目的基因的生物限制酶DNA连接酶质粒大肠杆菌等D 大肠杆菌等DNA连接酶限制酶提供目的基因的生物质粒答案：C解析：（1）供体是指提供目的基因的生物；（
6、2）限制酶能切割DNA分子，是基因的剪刀；（3）DNA连接酶能将DNA片段连接起来，是基因的针线；（4）运载体包括质粒、噬菌体或动植物病毒；（5）基因工程的受体可以是动物细胞、植物细胞或微生物细胞，但常以大肠杆菌等微生物细胞作为受体故选：C3、下列有关基因工程的叙述中，不正确的是()A.基因工程可以定向改变生物的性状B.基因的“剪刀”识别特定的DNA序列并在特定的位点切割DNA分子C.基因的“针线”能缝合由同种限制酶切割产生的黏性末端D.基因的运载体质粒只能从原核生物的细胞里获得答案：D解析：A、基因工程可以按照人们的意愿定向改造生物的性状，A正确；B、基因的“剪刀”识别特定的DNA序列并在特
7、定的位点切割DNA分子，B正确；C、基因的“针线”能缝合由同种限制酶切割产生的黏性末端，形成磷酸二酯键，C正确；D、基因的运载体质粒主要从原核生物的细胞里获得，D错误。故选：D。考点二 基因工程的基本操作程序及应用知识清单1、（2019全国卷）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括_和_。（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是_。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是_。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的_。（3）目前在P
8、CR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_。真题重现答案：(1)基因组文库;部分基因文库;(2)解旋酶;加热至9095;氢键;(3)Taq酶热稳定性高，大肠杆菌的DNA聚合酶在高温下会变性失活;解析：(1)基因工程的操作步骤:目的基因的获取(基因文库获取、PCR、人工合成);构建基因表达载体(含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点);把目的基因导入受体细胞(显微注射法、农杆菌转化法、钙离子处理法);目的基因的检测和鉴定(分子水平DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原抗体杂交法和个体水平抗虫、抗病接种实验等)。基因文库包括基因组文库和部分基因文库,前者包括一种生物的全部
9、基因,后者只包括一种生物的部分基因。(2)体内进行DNA复制时,需要解旋酶和DNA聚合酶,解旋酶可以打开双链之间的氢键,DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时,利用高温即加热至90-95度变性破坏双链之间的氢键,解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。(3)由于在PCR过程中,需要不断的改变温度,该过程中涉及较高温度处理变性,细胞内的DNA聚合酶在高温处理下会变性失活,PCR过程中需要用耐高温的DNA聚合酶催化。2、(2017全国卷)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基
10、因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题:(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是_。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用_作为载体,其原因是_。(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠肝菌作为受体。因为与家蚕相比,大肠杆菌具有_(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是_(选填“蛋白的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程理论的建立提
11、供了启示,那么,这一启示是_。答案：(1)在基因组中获得的基因A含有内含子，大肠杆菌中没有切除内含子对应的RNA序列的机制，因此大肠杆菌中基因A表达出的蛋白质与蛋白A不同;(2)噬菌体;病毒具有宿主专一性，噬菌体专一性的侵染细菌，不能将目的基因导入家蚕中;(3)易培养，繁殖快;(4)蛋白A的抗体;(5)外源DNA进入受体细胞中能正常表达解析：(1)从人基因组获得的基因A含内含子,而大肠杆菌为原核细胞,细胞中没有切除内含子对应的RNA序列的机制,因此大肠杆菌中基因A表达出的蛋白质与蛋白A不同。(2)噬菌体专一性的侵染细菌,不能将目的基因导入家蚕中。所以只能选择昆虫病毒,同为动物病毒,便可将目的基
12、因导入家蚕中了。(3)选择大肠杆菌作为受体,是因为大肠杆菌易获得,易培养,繁殖快,可快速得到大量产物。(4)检测是否翻译出蛋白质A,可采用抗原抗体杂交的方法,蛋白质A充当抗原,选择蛋白质A抗体与其特异性结合。(5)艾弗里等人曾经在S型肺炎双球菌分离出DNA、蛋白质、多糖等物质,分别与R型肺炎双球菌混合培养,发现S型肺炎双球菌的DNA能使R型肺炎双球菌转化为S型肺炎双球菌。从中知道转化的可能性,所以启示是:在特定条件下,DNA片段能进入细胞,并且还能发挥原有作用。模拟考场1、用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是()A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒B.DNA连接
13、酶和RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶C.常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒D.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达答案：B2、某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到 或 中会导致相应的基因失活（表示氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_
14、（答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_的固体培养基。（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。答案：（1）能自我复制、具有标记基因（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；含有质粒载体；含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质
15、粒）；二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长；四环素（3）受体细胞3、将细菌的聚羟基丁酸（PHB）生物合成基因导入拟南芥中，每克湿重植物可产10mgPHB。PHB具有热塑性好、可被微生物完全分解的特性，是最好的无污染性塑料的一种原料。请回答下列问题：（1）若要克隆从细菌中获取的PHB生物合成基因，可利用PCR技术，其原理是_；前提条件是_，以便合成引物。PCR反应体系中除目的基因、引物和缓冲液外，还需要加入_。（2）将PHB生物合成基因成功导入拟南芥细胞后，还需要进行分子水平上的检测和_水平的鉴定。若目的基因可以导入到拟南芥的体细胞中，也可以导入到种子中，后者会简化工艺，降低成本，
16、原因是_。（3）基因工程常用的载体有质粒、_（答出2点）等，其中被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造，结合所学知识分析对天然质粒改造的原因可能是_。答案：(1)DNA双链复制(或DNA半保留复制);要有一段已知目的基因(或PHB生物合成基因)的核苷酸序列;Taq酶(或热稳定DNA聚合酶)和dNTP(或dATP、dTTP、dGTP、dCTP)(2)个体生物学;因为后者不需要复杂的植物组织培养技术,将种子种下长成的植株就是转基因植物,所以简化了工艺,降低了成本(3)噬菌体的衍生物和动植物病毒;为鉴别受体细胞中是否含有目的基因,需要添加适当的标记基因或是需要添加(或替换)某种特定限制
17、酶的识别序列,或是需要添加某种特定基因的启动子(或终止子或启动子和终止子)解析：(1)PCR技术是一种体外DNA复制的过程,与体内DNA复制的实质相同,只有引物与单链DNA模板互补结合后,子链才能在Taq酶的作用下进行延伸;一个完整的PCR反应体系中需要有缓冲液、目的基因、引物、Taq酶和dNTP。(2)将目的基因导入受体细胞后,需要在分子水平上检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,目的基因是否转录出mRNA以及是否翻译成蛋白质,有时还需要进行个体生物学水平的鉴定;植物的体细胞作为受体细胞,由细胞到完整个体,需要激发体细胞的全能性,就需要结合植物组织培养技术,如果可以直接导入到植物的种子中,并能成功表达,种子发育之后即可形成转基因植株,可以简化工艺,降低成本。(3)基因工程常用的载体属识记内容,质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒是常用的载体;但天然质粒不一定满足具体所需要的条件,所以需要进行人工改造,比如是否具有相应的标记基因供重组DNA的鉴定和选择,是否具有一个至多个限制酶的切割位点,以便与目的基因进行连接,是否具有相应的启动子、终止子等以便目的基因能够正常表达等。