1、专题3 植物的组织培养技术课题3.1 菊花的组织培养庖丁巧解牛知识巧学一、植物组织培养的基本过程1.细胞分化植物的个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上都会出现稳定性的差异，形成这些差异的过程叫做细胞分化。高等生物一般都从一个受精卵开始发育，经多次细胞分裂与分化，产生出各种不同的特殊结构和专一功能的细胞。例如，植物体中的木纤维、韧皮纤维等。已分化的细胞，其基因组成并未改变，并无遗传信息的增减，仍具有发育的全能性。一般认为，细胞分化是细胞中遗传信息有选择地表达的结果。2.细胞的全能性细胞全能性比较权威的定义是1984年国际组织培养协会做出的：“细胞全能性为细胞的某种特征，有这种能力的细胞保
2、留形成有机体所有细胞类型的能力”。这个定义比一般所说的概念“一个细胞中包含着这种生物的全部遗传信息（基因），在适当的条件下可以发育成一个完整的生物体”更基本和全面。它不但包含了培养细胞再生成植株的情况（分化成各种类型的细胞，并以一定形式构建成植物），同时也包含了培养细胞生产次生代谢物的情况（不分化或只分化成某种类型细胞，但仍留着分化为其他细胞类型的能力）。前者成为组织培养和转基因植物需要进行植株再生的理论基础，后者成为像微生物发酵一样培养细胞，生产人们所需要的次生代谢产物的理论基础，如通过红豆杉的细胞培养生产紫杉醇。难点培析 （1）全能性的含义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整的个体的潜能。
3、 （2）全能性的基础：每个体细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体的全部基因。 （3）全能性程度：由高到低依次是受精卵生殖细胞体细胞 。（4）表现全能性的条件：离体营养物质激素。（5）与植物和低等细胞相比，高等动物体细胞的发育潜能有显著差异。3.植物组织培养的过程植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成完整植株的一项技术。植物组织中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化成为恢复分裂能力的细胞，叫做愈伤组织。愈伤组
4、织的排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。脱分化产生的愈伤组织继续培养，又可以重新分化为根或芽等器官，这个过程称为再分化。再分化形成的试管苗移栽到地里，可以发育成完整的植株。深化升华 植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。植物组织培养的过程可归纳为：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽完整的植物体二、影响植物组织培养的因素1.外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。对于同一种植物材料，材料
5、的年龄、保存时间的长短等也会影响实验效果。要点提示 生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化。菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。2.培养基是植物组织培养的重要基质在离体培养条件下，不同种植物组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。常用的一种培养基是培养，它是1962年由urashige和koog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和
6、原生质体培养，效果良好。MS培养基的主要成分包括：大量元素、微量元素、有机物等。在配制好的MS培养基中，常常需要添加植物激素。（1）大量元素，指浓度大于0.5 mol/L的元素，有N、a、g、等。（2）微量元素，指浓度小于0.5 mol/L的元素，有e、n、u、o、o等。（3）有机物，包括碳水化合物、维生素、肌醇、氨基酸等。碳水化合物，最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。维生素，维生素类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多项代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。肌醇，在适当的情况下使用肌醇，能
7、促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。氨基酸,是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他种类，如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。植物激素,是植物组织培养中发挥生物学效力最强的培养因素，也是人工调控组织培养的“魔术棒”。在植物组织培养中最常用的是生长素和细胞分裂素。生长素与细胞分裂素的协同调控作用在组织培养中很重要，即所谓的“激素杠杆”。激素的生物学效应是组织内源激素和人工添加的外源激素效应的总和。只有准确把握内源激素与外源激素的协同作用，才能有效地操作“激素杠杆”，做好植
8、物组织培养。在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度（10-510-8mg/L）下，就可促进生长。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。细胞分裂素有三个作用：首先是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素与生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽；其次是促进细胞分裂与扩大；再次是抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化，茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。疑点突破
9、 生长素与细胞分裂素的使用顺序不同，实验结果不同；同时使用时，两类激素的比例决定着发育的细胞类型，决定着愈伤组织再分化，是长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。辨析比较 微生物培养基与MS培养基的成分比较微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必需的大量元素和微量元素两大类。MS培养基中还含有少量的有机物、植物激素等。3.温度温度是组织培养过程中的重要因素。组织培养在最适温度下,生长分化表现良好，大多数组织培养都是在2327 之间进行。不同植物培养的最适温度不同。
10、4.光照组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质以及光照时间方面。光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响。 5.p不同的植物对培养基最适p的要求也是不同的，大多在56.5左右，一般培养基皆控制在.，这基本能适应大多植物培养的需要。p适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。6.气体氧气是组织培养中的必需因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养
11、基等。三、实验操作：菊花的组织培养1.制备MS固体培养基（1）母液的配置和保存大量元素母液可配成10倍液。微量元素母液可配成100倍液。维生素、激素类母液可配成1 mg/mL母液。制好的母液瓶上应分别贴标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配一升培养基时应取的量。（2）配制培养基配制1 L MS培养基时，先将称好的琼脂加入800 mL蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入蔗糖30 g，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1 000 mL。（3）培养基配好后，要调整pH。用0.1 M的NaOH或HCl液调到5.8左右。（4）培养基的分装与灭菌培养基要趁热分装，一
12、般100 ml的容器约装入3040 ml培养基。分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。2.外植体消毒对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。菊花茎段的消毒：流水冲洗加少许洗衣粉用软刷轻轻刷洗流水冲洗放入70酒精中摇动无菌水清洗放入0.1%的氯化汞溶液中处理12 min无菌水清洗3次。3.接种接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。以上已叙述接种前的材料表面的消毒灭菌，现将接种前后的程序连贯地介绍一遍。(1)将初步洗涤及切割的材料放入烧杯，带入超
13、净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗.最后沥去水分，取出放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。（2）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5 cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含12片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作是：先解开封口膜，将试管几乎水平拿着，试管口靠近酒精灯焰，将管口在火焰上方转动，让管口里外灼烧数秒钟，若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块外植体送入试管内，轻轻插入培养基上。若是叶片直接
14、附在培养基上，以放13块为宜。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。将封口膜重新扎好。要点提示 材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外，其他尚无统一要求。放置材料数量现在倾向于少放，人们通过统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样节约培养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃。4.培养指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长、分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。5.移栽移栽前应先打开培养瓶的封口膜，使之逐步由无菌环境到有菌环境，由人工培养环境过渡到自然环境。如出瓶苗要使用消毒的土壤、保湿、保温，同时还要做一定的壮苗处理，如增加光照和补充营养液等。经
15、过一系列的处理，一株组织培养出来的“克隆苗”就顺利成活了。6.栽培将幼苗移栽后，每天观察幼苗生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。难点培析 （1）无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键植物组织培养不同于扦插、分根、叶插等常规无性繁殖。由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高，对无菌操作的要求非常严格。如果不小心引起污染，将可能造成培养工作的前功尽弃。（2）妥善处理被污染的培养物 即使对于有经验的操作人员，操作后出现培养物被污染的情况也常有。一般情况下，细菌污染可能是由接种人员造成的，如未戴口罩，接种时说话，或手及器械消毒不严格等。真菌污染可能是植物材料灭菌不当。
16、需要特别注意的是，一旦发现培养材料被污染，特别是真菌性污染，一定不要打开培养瓶。应先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗。（3）生根苗移栽技术的关键生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系表面的培养基，又不能伤及根系。一般使用无土栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾，并用塑料薄膜覆盖12 h。掀开塑料薄膜后24 h才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是否合格。问题探究 问题1 探究组织培养过程中植物激素的作用。思路:在保证无关变量都相同的情
17、况下，设计对照实验：明确实验目的和原理找出相关变量（自变量、因变量、无关变量）确定控制变量的对照方法结合实验材料，设计实验方案利用相关对照，逻辑推理相关结论（或预期结果）。探究:第一组：不加任何植物激素；第二组：生长素与细胞分裂素用量的比值为11；第三组：两种植物激素用量比值大于1；第四组：两种植物激素用量比值小于1。观察不同实验条件对实验结果的影响。问题2 从红豆杉树皮中分离出的紫杉醇是当今世界公认的广谱、强活性的抗癌药物，它具有特殊抗癌机理，能与微管蛋白结合，并促进其聚合、抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细胞的增殖。紫杉醇不仅对卵巢癌、乳腺癌、肺癌有较好的作用，而且对其他疾病也有一定潜力，因此紫
18、杉醇日益成为许多国家研究的热点。而红豆杉却面临灭顶之灾。我国红豆杉资源储量有限，自1992年美国FAD正式批准紫杉醇为治疗晚期癌症药物以来，过度砍伐日益严重，我国红豆杉野生资源遭到了严重破坏。紫杉醇含量很低，一般仅为干重的0.006%0.06，而且红豆杉生长十分缓慢，很多生物学特性限制了自然种群的发展，据WHO组织统计，世界癌症的年发病人数达1000多万，预计年需红豆杉树皮约700吨，即使全球红豆杉天然资源采伐完，也仅够短期需要，而且这样做还会对地球环境和生物多样性造成不可弥补的损失。请与你的同学一起探究获取抗癌药物紫杉醇的途径有哪些。思路:获取抗癌药物紫杉醇的几种途径：红豆杉的人工种植途径，
19、植物组织培养途径，生物合成途径，化学合成及微生物生产途径等。目前组织培养是缓解需求的重要方法，生物、化学合成将是根本解决药源的最终途径，相信通过重点研究，紫杉醇高技术生产会很快实现。探究:植物组织培养途径获取抗癌药物紫杉醇的具体方法：选取红豆杉优良品种、优质器官（紫杉醇含量高）作为外植体，接种于培养基中经过愈伤组织形成、生根、幼苗形成等步骤，在实验室可获得大量的组培苗。再经过基质移栽、练苗、检疫后成为生产用苗，其数量是相当巨大的。也可利用组织培养技术对红豆杉细胞进行培养，直接分离提取得到紫杉醇。典题热题例1植物组织培养是指（）A.离体的植物器官、组织或细胞培育成愈伤组织B.愈伤组织培育成植株C
20、.离体的植物器官、组织或细胞培育成完整植物体D.愈伤组织形成并液泡化解析：植物组织培养是指在一定的条件下，将离体的植物器官、组织或细胞经脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成具有根、芽的幼苗，进而发育成为一株完整植物体的植物细胞工程技术。答案：C方法归纳 植物组织培养的概念要抓住“离体”“培育成完整的植物体”等关键词的理解。例2植物细胞表现出全能性的必要条件是（）A.给予适宜的营养和外界条件B.导入其他植物细胞的基因C.脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件D.将成熟筛管的细胞核移植到去核的卵细胞中解析：植物细胞表现出全能性的必要条件是：离体、适宜的营养物质和外界条件。答案：C误区警示 在植物体内部，细胞不能表现出全能性，是因为细胞内的基因的选择性表达，只有脱离母体，细胞在一定条件下才能表现出全能性。