1、基因工程(30分钟100分)1.(14分)PCR技术是分子生物学实验室里的一种常规手段,其原理是利用DNA的半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图所示),在很短的时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)PCR的全称是_,94 高温使DNA双链打开,这一步是打开_键,称为_。而这一过程在细胞内是通过_酶实现的。(2)当温度降低时,引物与模板_端结合,在耐高温的_的作用下,引物沿模板延伸,此过程中原料是_,遵循的原则是_。(3)PCR技术的必要条件除模板、原料、ATP、酶以外,至少还需要三个条件,即液体环境、适宜的_和_,前者由PCR仪
2、自动调控,后者则靠_来维持。(4)DNA的复制需要引物,其主要原因是_。引物的实质是_,若将1个DNA分子拷贝10次,则需要在缓冲溶液中至少加入_个引物。【解析】(1)PCR全称是多聚酶链式反应,94 高温使DNA双链打开,这一步是打开氢键,称为变性。这一过程在细胞内是通过解旋酶实现的。(2)当温度降至55 时,引物与模板链3端结合。加热至72 ,在耐高温的TaqDNA聚合酶的作用下,引物沿模板链延伸,此过程中原料是4种脱氧核苷酸,遵循的原则是碱基互补配对。(3)PCR技术必要条件除模板、原料、酶、ATP外,至少还需要液体环境,适宜的温度和pH,前者由PCR仪自动调控,后者靠缓冲液来维持。(4
3、)DNA复制需要引物的主要原因是DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3端延伸DNA链。引物的实质是单链RNA或单链DNA分子。在DNA分子扩增时,需要2种引物,由于新合成的链都需要引物作为复制的起点,故所需的引物数目等于新合成的DNA链的数目,即2210-2=211-2。答案:(1)多聚酶链式反应氢变性解旋(2)3Taq DNA聚合酶4种脱氧核苷酸碱基互补配对(3)温度pH缓冲液(4)DNA的复制不能从头开始,DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链单链RNA或者单链DNA分子211-22.(15分)(2020遵义模拟)R-7是家蚕体内的一种小分子非编码RNA,可与某些mRNA尾端的一段
4、非编码序列(3-UTR)结合,进而影响基因的表达。为研究R-7是否影响家蚕基因B(调控家蚕眼睛发育)的表达,科研人员将基因B中对应3-UTR的DNA片段与荧光素酶基因(R-7不影响荧光素酶基因的表达)重组后导入家蚕胚胎细胞观察其表达结果。请回答下列问题:(1)利用_技术扩增基因B中对应3-UTR的DNA片段,应先依据_合成引物。若对一个含基因B的DNA扩增n代,则共需消耗_对引物。(2)图甲中对应3-UTR的DNA片段应插入位点_,原因是_。重组载体中的荧光素酶基因在基因工程中作为_。(3)科研人员分别从实验组和对照组细胞中提取蛋白质,经处理检测后获得相对荧光值(在适宜条件下,荧光素酶可催化荧
5、光素发生氧化反应并发出荧光),其结果如图乙所示。实验组为将重组载体导入含R-7的家蚕胚胎细胞中,对照组1的处理为将含有荧光素酶基因的表达载体(不含对应3-UTR的DNA片段)导入含R-7的家蚕胚胎细胞中,则对照组2的处理应为_。依据实验结果可推知,R-7影响基因B的表达,即通过遵循_原则,R-7与基因B所转录的mRNA的3-UTR结合,进而_(填“促进”或“抑制”)基因B的表达。【解析】(1)利用PCR技术扩增基因B中对应3-UTR的DNA片段,利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。因此该空白的答案:应先依据该基因的一段核苷酸序列合成引物
6、。若对一个含基因B的DNA扩增n代,共得到2n个DNA,净增DNA为2n-1,因此共需消耗的引物为2n-1对。(2)依题意可知,R-7是家蚕体内的一种小分子非编码RNA,可与某些mRNA尾端的一段非编码序列(3-UTR)结合,进而影响基因的表达。也即3-UTR位于某些mRNA的尾端,由于mRNA是以DNA分子的一条链为模板转录而来的,因此图甲中对应3-UTR的DNA片段应插入位点2,原因是目的基因应插入启动子与终止子之间,且不能破坏荧光素酶基因,重组载体中的荧光素酶基因在基因工程中作为标记基因。(3)由图乙可知实验组的相对荧光值较低,而对照组1和对照组2的相对荧光值较高。又因为对照组1的处理为
7、将含有荧光素酶基因的表达载体(不含对应3-UTR的DNA片段)导入含R-7的家蚕胚胎细胞中,说明没有R-7片段的细胞中荧光素酶基因正常表达,相对荧光值较高。实验组为将重组载体导入含R-7的家蚕胚胎细胞中,相对荧光值较低,说明R-7抑制了荧光素酶基因的表达。由此可以推测对照组2的处理应为将重组载体导入不含(或去除)R-7的家蚕胚胎细胞中。基因的表达包括转录和翻译,在转录和翻译的过程中都遵循碱基互补配对原则。依据实验结果可推知,R-7影响基因B的表达,即通过遵循碱基互补配对原则,R-7与基因B所转录的mRNA的3-UTR结合,进而抑制基因B的表达。答案:(1)PCR该基因的一段核苷酸序列2n-1(
8、2)2目的基因应插入启动子与终止子之间,且不能破坏荧光素酶基因标记基因(3)将重组载体导入不含(或去除)R-7的家蚕胚胎细胞中碱基互补配对抑制3.(11分)(2021蚌埠模拟)引起人类产生埃博拉出血热的埃博拉病毒(EBOV),是一种单链RNA病毒,某研究团队利用其跨膜表面糖蛋白(GP),以重组腺病毒为载体采用转基因技术研发了埃博拉疫苗。请回答下列问题:(1)为了判断是否感染EBOV,采用逆转录PCR技术进行核酸检测,具体过程是先将待测样本RNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板进行扩增,则逆转录成cDNA的过程中所需的原料是_, PCR的原理是_,其中所需要的酶是_。(2)基因表达载体构建时
9、,需要用同种限制酶切割目的基因和运载体,其目的是_。通常运载体上带有抗生素的抗性基因,其作用是_。(3)将重组质粒导入人的胚胎肾细胞所采用的方法是_,培养胚胎肾细胞需要CO2,其作用是_,此基因工程成功的标志是_。【解析】(1)根据题意分析,以样本RNA为模板逆转录成cDNA的原料是脱氧核苷酸;PCR的原理是体内DNA的复制,该过程需要耐高温DNA聚合酶的催化。(2)构建基因表达载体时,需要用同种限制酶切割目的基因和运载体,以产生相同的黏性末端,利于目的基因和运载体连接;运载体上的抗生素抗性基因为标记基因,可以用于筛选出含有目的基因的受体细胞。(3)将重组质粒导入人的胚胎肾细胞(动物细胞)常用
10、显微注射法;培养胚胎肾细胞需要一定的气体条件,培养箱中CO2的作用是维持培养液的pH相对稳定;该研究团队利用其跨膜表面糖蛋白(GP),以重组腺病毒为载体采用转基因技术研发了埃博拉疫苗,因此,此基因工程成功的标志是受体细胞产生跨膜表面糖蛋白(GP)。答案:(1)4种脱氧核苷酸体内DNA的复制耐热的DNA聚合酶(Taq酶)(2)产生相同的黏性末端,利于目的基因和运载体连接便于筛选出含有目的基因的受体细胞(3)显微注射法维持培养液的pH相对稳定受体细胞产生跨膜表面糖蛋白(GP)4.(15分)(2021桂林模拟)L-肉碱具有参与脂肪氧化、抗疲劳、延迟患阿尔茨海默综合症等功能。据报道大肠杆菌能将巴豆甜菜
11、碱转化成L-肉碱,但效率较低。科研人员通过基因工程将BCD基因、F基因以及T基因导入大肠杆菌细胞内以提高L-肉碱的转化率。实验过程及结果如图所示,分析并回答下列问题:(1)实验过程中用PCR技术获得目的基因,PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和_。实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入大肠杆菌细胞内,而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌,原因是_,并能遗传给下一代。图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7,T7是_识别和结合的部位,能驱动基因转录。(2)将重组质粒1和重组质粒2导入大肠杆菌时,应用_处理大肠杆菌,使细胞处于_的感受态。(3)
12、为了筛选出同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌,实验的思路是_。(4)研究发现巴豆甜菜碱转化成L-肉碱是一个可逆反应过程,得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后,L-肉碱的含量基本稳定,此时可以_,以提高产量。【解析】(1)多聚酶链式反应(PCR),是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和(两种)引物。由于目的基因无法直接在受体细胞中表达,因此为了使目的基因在受
13、体细胞中稳定存在,能够表达,实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入大肠杆菌细胞内,而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌,并能遗传给下一代。图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7,T7是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录。(2)使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内,主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用Ca2+处理,使细胞处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态,使含有目的基因的重组质粒容易进入受体细胞。(3)重组质粒1上含有BCD基因、T基因及卡那霉素抗性基因,重组质粒2上含有F基因、T基因及氯霉素抗性基因,因此在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上
14、挑选单克隆大肠杆菌,就是同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌。(4)研究发现巴豆甜菜碱转化成L-肉碱是一个可逆反应过程,在可逆反应中,减少生成物浓度,可使反应向正方向进行。因此得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后,L-肉碱的含量基本稳定,此时可以及时移除产物(更换培养液),使反应向生成L-肉碱的方向进行,以提高产量。答案:(1)(两种)引物使目的基因在受体细胞中稳定存在,能够表达(使目的基因在受体细胞中完成转化)RNA聚合酶(2)Ca2+易于吸收周围环境中DNA分子(3)在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上挑选单克隆大肠杆菌 (4)及时移除产物(更换培养液),使反应向生成L
15、-肉碱的方向进行【加固训练】浙江大学农学院喻景权教授课题组研究发现,一种植物激素油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后,许多参与农药降解的基因(如P450基因和红霉素抗性基因)的表达和酶活性都得到提高,在这些基因“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质,有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作,请回答下列问题: (1)获得油菜素内酯合成酶基因的方法有_。步骤用PCR技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指_;步骤用到的酶有_。(2)图中导入重组质粒的方法是_,在导入之前需用一定浓度的_处理受体细菌。(3)导入重组质粒2以后,往往还
16、需要进行检测和筛选,可用_制成探针,检测是否导入了重组基因,在培养基中加入_可将含有目的基因的细胞筛选出来。(4)请你为该课题命名:_。【解析】进行基因工程操作时,首先要获取目的基因,其方法有多种:从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增技术等。在构建基因表达载体的过程中,用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌,故用感受态细胞法导入基因表达载体,导入后,需检测和筛选。从图中可以看出,最终是通过对照实验来检验转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。答案:(1)从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增技术(任选其中两项即可
17、)TaqDNA聚合酶限制酶和DNA连接酶(2)感受态细胞法CaCl2溶液(3)红霉素抗性基因红霉素(4)探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解5.(11分)(2021河北模拟)胶原蛋白广泛应用于医学、化妆品、化工原料等领域,科研人员开展利用家蚕生产人胶原蛋白的研究。请回答下列问题:(1)家蚕核型多角体病毒(BmNPV)专性寄生于鳞翅目昆虫,将人胶原蛋白基因与_重组后,构建_。体外克隆目的基因的方法是_。(2)BmNPV的p10基因是极强的启动子,将目的基因连接在p10基因的下游,目的是_。目的基因与p10基因连接时,断裂与连接的化学键都是_。(3)重组BmNPV感染家蚕幼虫后,在幼虫淋巴液中提
18、取蛋白质,用_的方法检测目的基因是否成功表达。相比于大肠杆菌,选择家蚕作为人胶原蛋白的生物反应器,其优点是_。【解析】(1)因为BmNPV专性寄生于鳞翅目昆虫,故将目的基因与BmNPV基因重组,构建基因表达载体,更有利于将目的基因导入家蚕细胞。PCR是指在体外复制特定DNA片段,可在短时间内大量扩增目的基因。(2)启动子位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录。将目的基因与运载体连接时,限制酶和DNA连接酶作用的都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质,可用抗原-抗体杂交的方法。大肠杆菌为原核细胞,家蚕为真核生物,家蚕细胞中的内质网和高尔基体会
19、对人胶原蛋白进行加工,与人体内表达的蛋白质结构和功能更相似。答案:(1)BmNPV基因基因表达载体PCR技术(2)使目的基因在p10基因的驱动下高效表达磷酸二酯键(3)抗原-抗体杂交家蚕细胞的内质网和高尔基体会对人胶原蛋白进行加工,使表达的胶原蛋白与人的胶原蛋白的结构和功能相似6.(11分)(2021衡水模拟)我国一科研团队将小麦液泡膜Na+/K+逆向转运蛋白基因(TaNHX2基因)转移到水稻细胞内,获得了转基因耐盐水稻新品种。回答下列有关问题:(1)获取目的基因的方法很多。若已知TaNHX2基因序列,可以用_扩增该基因。首先根据序列设计、合成_并投入反应体系,同时,还需要放入dNTP、目的基
20、因、Taq酶等。还可以人工合成TaNHX2基因。如图1表示人工合成的两条若干个碱基的DNA单链,两条链通过18个碱基对形成部分双链DNA片段,再利用Klenow酶补平,获得双链DNA。从功能看,Klenow酶是一种_酶。(2)图2是3种限制酶的识别与酶切位点示意图,构建基因表达载体时,经BamH 酶切割得到的目的基因可以与图3所示质粒被_酶切后的产物连接,理由是_。连接后的重组质粒_(填“能”“不能”或“不一定能”)被BamH 切割。(3)基因表达载体通过农杆菌转化作用,就可以使目的基因进入植物细胞,并将其_,使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。(4)小麦与水稻差异很大,但通过基因重组后,
21、水稻却能够合成小麦的蛋白质,这是因为_。【解析】(1)扩增目的基因常采用PCR技术;需要根据设计序列合成引物;从图中看出Klenow酶的作用是以DNA分子的一条链为模板,以脱氧核苷酸为原料合成DNA分子,催化磷酸二酯键的形成,所以是一种DNA聚合酶。(2)由图2可知,BamH 酶和Sau3A 酶两种酶切割片段产生的黏性末端互补,故经BamH 酶切割得到的目的基因可以与图3所示质粒被Sau3A 酶切割后的产物连接。连接后的重组质粒可能形成不同的序列,所以不一定能再被BamH 切割。(3)基因表达载体通过农杆菌转化作用,就可以使目的基因进入某植物根细胞,并将其插入植物细胞的染色体DNA上,使目的基
22、因的遗传特性得以稳定维持和表达。(4)小麦与水稻差异很大,但小麦和水稻共用一套遗传密码,故通过基因重组后,水稻能够合成小麦的蛋白质。答案:(1)PCR技术引物DNA聚合(2)Sau3ABamH和Sau3A两种酶切割片段产生的黏性末端互补不一定能(3)插入植物细胞的染色体DNA上(4)水稻和小麦共用一套遗传密码7.(11分)科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因,提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力,从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题:(1)PCR过程所依据的原理是_,利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一
23、序列合成_;扩增过程需要加入_酶。(2)启动子是一段有特殊结构的DNA片段,其作用是_。目的基因能在不同生物体内正常表达原来的蛋白质,说明整个生物界_。PCR定点突变技术属于_的范畴。(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体。常用_法将基因表达载体导入植物细胞,还需用到植物细胞工程中的_技术来最终获得转基因植物。【解析】(1)PCR依据的原理是DNA双链复制,在用PCR技术扩增目的基因前要依据一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列合成引物;扩增过程需要加入耐高温的DNA聚合(或TaqDNA聚合)酶。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录出mRNA;因生物界共用一套遗传密码,所
24、以目的基因可以在不同细胞内表达合成相同蛋白质。(3)常用农杆菌转化法将基因表达载体导入植物细胞,借助于植物组织培养技术,获得转基因植物。答案:(1)DNA双链复制引物耐高温的DNA聚合(或TaqDNA聚合)(2)RNA聚合酶识别和结合的部位,可驱动基因转录出mRNA共用一套密码子蛋白质工程(3)农杆菌转化植物组织培养8.(12分)(2020攀枝花模拟)MAP30蛋白是一种能使型核酸核糖体失活的蛋白质,存在于苦瓜果实和种子中。实验表明,MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能,近年来引起人们的广泛关注。现有一科研团队欲培育高效表达该蛋白基因的马铃薯新品种。请回答下列问题:(1)若要获取MAP
25、30蛋白基因,人们可从_基因库中获得。获得目的基因后可利用PCR技术对其进行扩增,所用的缓冲液中除目的基因外,应包括_等物质。(2)构建基因表达载体时,需要使用的酶是_。为了避免出现“目的基因自我环化”“目的基因在运载体上反向连接”的问题,常用的解决办法是_。(3)将基因表达载体导入马铃薯受体细胞后,可用_技术得到转基因幼苗。检测MAP30蛋白基因是否在受体细胞中成功表达,可用_检测。(4)科研人员为了研究MAP30蛋白抗弧菌的效果,用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌,绘制弧菌生长曲线如图:由图可以得出的结论是_。【解析】(1)获取目的基因,要从含有该基因的苦瓜基因库中寻找。利用PCR技
26、术扩增该基因,PCR反应体系的主要成分应该包含4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、引物、热稳定DNA聚合酶、扩增缓冲液等。(2)构建基因表达载体需要使用到的酶是限制酶和DNA连接酶;为了避免出现“目的基因自我环化”“目的基因在运载体上反向连接”的问题,可分别使用两种限制酶去剪切目的基因和运载体。(3)可用植物组织培养技术得到转基因幼苗,可通过抗原-抗体杂交技术检测MAP30蛋白基因是否成功表达。(4)用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌,根据图中曲线显示,随着MAP30蛋白浓度的升高,MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强;当MAP30蛋白浓度达到或高于500职g/mL时,弧菌生长完全被抑制。答案:(1)苦瓜4种脱氧(核糖)核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)(2)限制酶和DNA连接酶 分别使用两种限制酶去剪切目的基因和运载体(3)植物组织培养抗原抗体杂交技术(4)随着MAP30蛋白浓度的升高,MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强;当MAP30蛋白浓度达到或高于500 g/mL时,弧菌生长完全被抑制