1、第十三章现代生物科技专题第34讲基因工程浙江学考选考考纲确认考点知识内容加试一、基因工程1.工具酶的发现和基因工程的诞生a2.基因工程的原理和技术b3.基因工程的应用a4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案c考点| 基因工程的工具、操作步骤、应用1基因工程的诞生(1)概念：把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另外一种生物的细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。(2)核心：构建重组DNA分子。(3)诞生时间：20世纪70年代。(4)理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构的确立以及遗传信息传递方式的认定。(5)技术保障：
2、限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒载体的发现和运用。2基因工程的工具(1)限制性核酸内切酶来源：主要从原核生物中分离纯化出来。作用a特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。b切割两个核苷酸之间的化学键。结果：产生粘性末端。(2)DNA连接酶作用：将具有相同粘性末端的两个DNA片段连接在一起。(3)质粒从存在位置看，在细菌中独立于拟核之外。从化学成分上看，为双链环状DNA分子。从功能上看，能自主复制。从结构上看，常含有抗生素抗性基因。3基因工程的原理和技术(1)获得目的基因(2)形成重组DNA分子用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，以产生相同的粘性末端。用DNA连接酶连
3、接两个切口(即相同的粘性末端)，形成重组DNA分子。(3)将重组DNA分子导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。导入方法：用氯化钙处理大肠杆菌，可以增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使重组质粒容易进入。(4)筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达筛选：用含抗生素的培养基培养受体细胞，选择含重组质粒的受体细胞。表达：目的基因在宿主细胞内表达，产生人们需要的功能物质。4基因工程的应用(1)基因工程与遗传育种转基因植物培育优点转基因动物a含义：转入了外源基因的动物。b培育优点：省时、省力。(2)基因工程与疾病治疗基因工程药物如通过大肠杆菌生产胰岛素治疗糖尿病，通过酵母菌
4、生产乙肝疫苗等。基因治疗指的是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。(3)基因工程与生态环境保护利用转基因植物生产聚羟基烷酯，用于合成可降解的新型生物塑料。改造分解石油的细菌，提高其分解石油的能力。利用转基因微生物吸收环境中的重金属，降解有毒化合物和处理工业废水。1基因工程的三大操作工具(1)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(限制酶)的作用用限制酶切割时断开的是DNA分子中的磷酸二酯键(即相邻脱氧核苷酸间的键)，而不是两条链之间的氢键。如下图： 限制性核酸内切酶具有专一性，表现在两个方面：a识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。b切割特定序列中的特定位点。如图
5、：(2)DNA连接酶DNA连接酶的作用将两个来源不同的DNA用相同的限制性核酸内切酶切割，形成相同的粘性末端(或平末端)。DNA连接酶能催化磷酸与脱氧核糖之间化学键的形成，将两个DNA末端的缝隙“缝合”起来。如图： (3)载体的种类及作用载体应具备的特征a能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。b有1个或多个限制性核酸内切酶切点，以便与外源基因连接。c具有某些标记基因，以便进行筛选。载体的种类a细菌质粒，最常用大肠杆菌质粒。b噬菌体和某些动植物病毒。一般来说天然的载体往往不能满足人们的所有要求，因此人们会根据不同目的和需求，对某些天然的载体进行人工改建。作用一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细
6、胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。2基因工程基本操作步骤基因工程基本操作“五步曲”(1)获得目的基因序列未知：建立一个包括目的基因在内的基因文库，再从基因文库中获取。序列已知：用化学方法(如逆转录法)合成或者用PCR技术扩增目的基因。PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件原料、模板、酶、能量等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子(2)形成重组DNA分子一般采用同种限
7、制性核酸内切酶切割质粒和目的基因，以获得相同的粘性末端，以利于形成重组DNA分子，但有时用不同的限制性核酸内切酶处理也可以获得相同的粘性末端。目的基因的插入可能会破坏转基因生物原有基因的结构，影响转基因生物的正常生长，甚至致死。限制性核酸内切酶只识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，对RNA不起作用。用DNA连接酶连接时，可形成3种不同的连接物：目的基因载体连接物、载体载体连接物、目的基因目的基因连接物，导入受体细胞后，可利用是否具有抗性基因在选择培养基上进行筛选。(3)将重组DNA分子导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2处理法受体细胞体细胞受精
8、卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的TDNA上导入农杆菌侵染植物细胞目的基因稳定维持和表达将重组DNA分子提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞使之成为感受态细胞重组DNA分子与感受态细胞融合感受态细胞吸收DNA分子(4)筛选含有目的基因的受体细胞原理：质粒上有抗生素抗性基因等标记基因。方法：利用选择培养基筛选。举例：所有受体细胞四环素培养基生活的受体细胞导入培养3限制酶选择的注意事项图甲图乙(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst I。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sm
9、a I。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst I和EcoR I两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类：所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的粘性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中使用限制酶Sma I会破坏标记基因；如果所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。4有关基因工程操作易错分析(1)基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库
10、中的基因保存在受体菌中。(2)原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。(3)植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。(4)操作工具有三种，但工具酶常用两种，载体不是酶；在基因工程操作步骤“获得目的基因”和“形成重组DNA分子”两个过程中通常用同种限制酶，目的是产生相同的粘性末端；DNA连接酶只在“形成重组DNA分子”操作中用到。(5)一般情况下，用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制性核酸内切
11、酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。(6)标记基因的作用和种类：标记基因的作用筛选、检测目的基因是否导入受体细胞；常见的标记基因有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。1在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较高的应用价值。如图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题： (1)获取目的基因的主要途径包括从基因文库中获取和_。(2)过程需要的酶有_、_。(3)重组质粒除了带有抗冻蛋白基因afp以外，还必须含有启动子、终止子和_，这样才能构成一个完整的基因表达载体。(4)如果受体细胞C1是土壤农杆菌，则
12、将目的基因导入它的目的是利用农杆菌的_，使目的基因进入受体细胞C2，并将其插入到受体细胞C2中的_上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，形成转基因莴苣。【解析】(1)获取目的基因的主要途径有从基因文库中和化学方法合成。(2)过程为形成重组DNA分子，需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(3)一个完整的基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。(4)农杆菌转化法利用的是农杆菌的转化作用，将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，进而使目的基因能够稳定遗传和表达。【答案】(1)化学方法合成(2)限制性核酸内切酶DNA连接酶(3)标记基因(4)转化作用染色体DNA2下图是某研究小
13、组利用基因工程技术将抗农药马拉硫磷小菜蛾的羧酸酯酶(CarE)基因导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。请回答下列问题：(1)过程是以mRNA为模板，在_酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在_的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。(2)过程需要使用_技术扩增目的基因，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板DNA、4种脱氧核糖核苷酸和_。(3)CarE基因和表达载体一般用_切割后，通过DNA连接酶连接，以构建重组表达载体。(4)过程可利用_(分子检测技术)鉴定目的基因是否已导入受体细胞。(5)图示中，_是基因工程的核心步骤。A过程和B构建重组表达载体C过程D过程【解析】(1)过程
14、以mRNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。(2)目的基因通常通过PCR技术扩增，PCR技术的实质是在体外进行DNA的复制，这一过程需要通过高温解旋，因此需要耐热性的DNA聚合酶催化DNA的合成。(3)重组表达载体的构建需要先用相同的限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA和载体，再用DNA连接酶进行连接。(4)可利用经过特定处理的目的基因作探针，通过DNA分子杂交技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞。(5)基因工程的核心步骤是构建重组DNA分子，即重组表达载体。【答案】(1)逆转录DNA聚合酶(2)PCR耐热性的DNA聚合酶(3)相同的限制性核酸内切酶(4)DNA分子杂交技术(5)B