1、课题3 血红蛋白的提取与分离1使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为图中（）2电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快？（）A纤维状、大分子 B纤维状、小分子C球状、大分子 D球状、小分子3将人红细胞置于盛有下列液体的离心管中，10 min后离心，得到沉淀物和上清液，则上清液中K含量最高的离心管内盛有（）A质量分数为10%的氯化钠溶液B质量分数为20%的蔗糖溶液C质量分数为0.9%的氯化钠溶液D蒸馏水4下列有关提取和分离血红蛋白的实验叙述错误的是（）A该实验的材料必须选用鸡血B通过透析法可以去除样品中分子质量较小的杂质，此为样品的粗提取C凝胶色谱法是利
2、用蛋白质的相对分子质量的大小分离蛋白质D电泳法是利用各种分子带电性质的差异及分子的大小和形状不同进行分离5下列关于电泳的说法，不正确的是（）A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率完全取决于它所带净电荷的多少D用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质电泳迁移率完全取决于分子的大小6在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是（）A防止血红蛋白被氧化B血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和C磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程D让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能7凝胶色谱分离法分离蛋白质时，凝胶的种类
3、较多，但其作用都是（）A改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C将酶或细胞固定在凝胶中D与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度8将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是（）A血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层B甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层C脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层9下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是（）A红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B血红蛋白的释放：加入
4、生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离D透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h10凝胶柱制作的顺序一般是（）橡皮塞打孔挖凹穴玻璃管插入橡皮塞孔内盖尼龙网用尼龙纱将橡皮塞上部包好将包好的橡皮塞插入玻璃管连接尼龙管、装螺旋夹柱顶部插入安装了玻璃管的橡皮塞ABCD11关于凝胶色谱柱的装填，除哪项外均为正确解释？（）A交联葡聚糖凝胶（Sephadex G75）“G”表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值B色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装C用300 mL物质的量浓度为20
5、 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 hD凝胶用自来水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液12下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是（）A加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐B让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面C打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱D待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液13血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。（1）将实验流程补充完整：A为_，B为_。凝胶色谱法是根据_达到蛋白质分离的有效
6、方法。（2）洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高和时间过长会使_一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。（3）在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7.0）的目的是_。如果红色区带_，说明色谱柱制作成功。14凝胶色谱技术是20世纪60年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单，操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答下面的问
7、题。（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_，原因是_。（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_替代。（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_。（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体_（填“相同”或“不同”），洗脱时，对洗脱液的流速要求是_。15某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下：请回答下列有关问题。（1）样品处理中红细胞的洗涤要用_反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是
8、_。（2）血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是_，若要尽快达到理想的透析效果，可以_（写出一种方法）。（3）电泳利用了待分离样品中各种分子的_等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。（4）一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有_种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是_。参考答案1解析：本题考查对凝胶色谱法分离蛋白质原理的理解，相对分子质量较大的蛋白质留在颗粒外面，相对分子质量较小的蛋白质进入颗粒内部；相对分子质量大的蛋白质通过凝胶间隙先被洗脱，相对分子质量小的蛋白质进入凝胶内部而后被洗脱。答案：B2解析：电泳
9、就是利用了连续分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同。一般来说，球状分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。答案：D3解析：红细胞在蒸馏水中渗透吸水涨破，所以细胞中K流出，使上清液中K含量较高。答案：D4解析：因为鸡血细胞中含有细胞核以及各种复杂的细胞器，会给提取血红蛋白带来一定的难度，故提取血红蛋白一般选用哺乳动物的成熟红细胞。答案：A5解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移
10、率完全取决于分子的大小。答案：C6解析：利用磷酸缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于分离观察（红色）和研究（活性）。答案：D7解析：凝胶的种类较多，但每一种凝胶内部都有孔隙。相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量小的容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。答案：A8解析：混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是，第1层为无色透明的甲苯层，第2层白色薄层固体是脂溶性物质沉淀层，第3层红色透明液体是血红蛋白
11、溶液，第4层暗红色沉淀物主要是红细胞破碎物沉淀。答案：D9解析：对红细胞进行洗涤时，应加入生理盐水，防止细胞破裂；将血红蛋白从红细胞中释放时，需要加入蒸馏水，以便使红细胞破裂释放出血红蛋白；透析时，应将透析袋置于pH为7.0的磷酸缓冲液中透析12 h。答案：C10解析：凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管选择合适的橡皮塞打孔挖凹穴玻璃管插入橡皮塞孔内盖尼龙网用尼龙纱将橡皮塞上部包好将包好的橡皮塞插入玻璃管连接尼龙管装螺旋夹柱顶部插入安装了玻璃管的橡皮塞。答案：B11解析：本实验中使用的交联葡聚糖凝胶（Sephadex G75），其中G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即
12、每克凝胶膨胀时吸水7.5 g；气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，因此，一旦发现有气泡，必须重装；在洗脱过程中，应在约50 cm高的操作压下，用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h，以使凝胶装填紧密；凝胶溶胀时，应使用蒸馏水将其充分溶胀，制成凝胶悬浮液。答案：D12解析：打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，再用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱。答案：C13解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质分离与提取过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和
13、纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术。答案：（1）血红蛋白的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小（2）杂蛋白（血浆蛋白）血浆蛋白白细胞和淋巴细胞离心后的上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯（3）准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致均匀一致地移动14解析：用凝胶色谱法分离各种物质时，大分子物质先洗脱出来。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一个凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物
14、质的下移速度落后于大分子物质，从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以减少凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。答案：（1）aa的相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快（2）尼龙网和尼龙纱（3）气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果（4）相同保持稳定15解析：（1）洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水，根据渗透作用原理，将红细胞置于低渗溶液中，
15、红细胞会吸水涨破，释放出血红蛋白。（2）血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去样品中的小分子杂质。可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法缩短透析时间，尽快达到理想的透析效果。（3）由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异，在电泳过程中会产生不同的迁移速度，从而实现各种分子的分离。（4）根据图示可知，镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白，原因是携带者具有（控制血红蛋白的）一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质。答案：（1）生理盐水渗透原理（当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破）（2）除去小分子杂质增加缓冲液的量或及时更换缓冲液（3）带电性质以及分子大小、形状（4）2携带者具有（控制血红蛋白的）一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质7