1、1.限制酶的选择原则（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择
2、的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst 因其会破坏标记基因而不宜选择。所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中Hind会破坏启动子，EcoR会破坏终止子，而Nde和BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。（3）参考Ti质粒的TDNA片段选择限制酶若质粒上标出TDNA片段，则所选限制酶切点应位于TDNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到TDNA片段上因
3、为Ti质粒的TDNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba 和Sac （两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）2.目的基因的检测与鉴定（1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的
4、培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。（2）使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA。（3）采用“抗原抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与相应抗体
5、杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。（4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测。【例证】 （2016全国卷，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR、BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一的）。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）经BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是_（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种
6、重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有，不能表达的原因是_图（c）（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。慧眼识图获取信息（1）三种限制酶切割结果分析（2）表达载体与重组DNA分子分析答案（1）Sau3A两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（3）EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶1.（2018南京、盐城、连云港二模）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。下
7、图为“转基因酵母乙肝疫苗”的生产过程示意图，该过程所用酵母菌为毕赤酵母菌，其体内无天然质粒，科学家改造出了下图所示的pPIC9K质粒（松弛控制型，复制不受宿主细胞控制）用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。请回答下列问题：（1）如果要将 HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在 HBsAg基因两侧的A和B位置接上限制酶的识别序列，这样设计的优点是可避免质粒和目的基因的自身环化。步骤1应选用（选填“Ecoli”或“T4”）DNA连接酶。 （2）步骤2的目的是。已知大肠杆菌每20 min分裂一次，若1个大肠杆菌中导入了1
8、0个重组质粒，则1 h后可从1个大肠杆菌的后代中得到重组质粒的个数。 （3）步骤4中应选用限制酶切割重组质粒以获得一段线性DNA，然后将其导入毕赤酵母菌细胞。为了确认毕赤酵母菌转化是否成功，应在培养基中加入以便筛选。除此以外，还可以用分子杂交技术鉴定上图中的毕赤酵母菌转化是否成功，过程如下图所示： 根据图中显示结果推算，若要获得16个成功导入该基因的酵母菌菌落，则上图A中的酵母菌菌落数至少要为个。 （4）已知质粒在细胞传代过程中有丢失现象，试分析毕赤酵母表达系统的遗传稳定性高于大杆菌表达系统的主要原因是_。 解析（1）如果要将 HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，HBsAg基因插入的位置应该
9、在pPIC9K质粒的启动子和终止子之间，pPIC9K质粒的启动子和终止子之间有限制酶SnaB 和Avr 的识别位点，所以在 HBsAg基因两侧的A和B位置要接上限制酶SnaB 和Avr 的识别序列，可避免质粒和目的基因的自身环化。限制酶SnaB 切割后是平末端，限制酶Avr 切割后是黏性末端，而T4DNA连接酶既可连接平末端又可连接黏性末端，所以步骤1应选用T4DNA连接酶。（2）步骤2是将重组质粒导入大肠杆菌体内进行扩增，以获得大量重组质粒。pPIC9K质粒是松弛控制型，复制不受宿主细胞控制，所以无法确定1个大肠杆菌复制3次后得到重组质粒的个数。（3）由步骤4中获得的一段线性DNA两侧序列可
10、知，应选用限制酶Bgl 切割重组质粒，该线性DNA中含卡拉霉素抗性基因，应在培养基中加入卡拉霉素以便筛选转化成功的毕赤酵母菌。由图可知，图A中的酵母菌菌落数为15个时，用分子杂交技术鉴定有2个转化成功，所以要获得16个成功导入该基因的酵母菌菌落，图A中的酵母菌菌落数至少要为16215120个。（4） 毕赤酵母表达系统中目的基因整合到酵母染色体上，不易丢失，而大肠杆菌表达系统中质粒在细胞传代过程中有丢失现象，所以毕赤酵母表达系统的遗传稳定性更高。答案（1）SnaB 和Avr T4（2）获得大量重组质粒（扩增）不确定（3）Bgl 卡拉霉素120（4）目的基因整合到酵母染色体上，不易丢失2.（201
11、8淮中、南师附中、海门、天一四校联考）基因表达载体的构建是基因工程的核心。图1为限制酶EcoR的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。回答下列问题：（1）若用图1所示的限制酶EcoR切割外源DNA，就其特异性而言，切开的是之间相连的化学键。 （2）图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是（多选）。A.若图中的ACT能决定一个氨基酸，则ACT可称为一个密码子B.DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于处，解旋酶作用于处C.若只用这个片段中的3个碱基对，排列出的DNA片段有64种D.就游离的磷酸基而言，该片段与重组质粒相比多了2个游离的磷酸基（3
12、）若利用PCR技术增加目的基因的数量，由图2可知，A、B、C、D 4种单链DNA片段中应选取作为引物（DNA复制子链的延伸方向53）。该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生等长的目的基因片段个。 （4）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，提高重组效率，应该选择的限制酶是。如果用限制酶Pst、EcoR和Hind同时对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切断且每次机会相等，则形成含有完整抗四环素基因的DNA片段有种。 （5）如果大肠杆菌是受体细胞，则其体内应不含基因，以利于筛选出含重组质粒的受体菌。目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传学基础是_。解析（1
13、）限制酶EcoR识别序列为GAATTC，切割位点在G与A之间，切开的是鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸之间相连的磷酸二酯键。（2）决定氨基酸的密码子在mRNA上，A错误；DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于磷酸二酯键处，解旋酶作用于氢键处，B正确；假设只用这个片段中的3个碱基对，排列出的DNA片段一定小于64种，C错误；该片段含2个游离的磷酸基团，重组质粒是环状DNA，不含游离的磷酸基团，D正确。（3）由于DNA复制时子链的延伸方向为53，所以选C和B作为引物。该DNA分子在PCR仪中经过3次循环后会产生2个等长的目的基因片段，经过n次循环后产生等长的目的基因片段为2n2n个，4次循环后会产
14、生等长的目的基因片段8个。（4）为了使目的基因和质粒定向连接应该选择双酶切，质粒上至少要有一个标记基因存在，所以用限制酶Pst、EcoR。用限制酶Pst、EcoR和Hind同时对质粒进行切割，若顺时针方向Pst与EcoR之间的片段为a，EcoR与Hind之间的片段为b，Hind与Pst之间的片段为c，则只有任意两个位点被切断且每次机会相等时，形成的片段有a、bc、b、ac、c、ab，其中含有完整抗四环素基因的DNA片段只有bc这1种。（5）经以上分析，重组质粒构建时，抗青霉素基因被破坏，只保留了抗四环素基因，所以为了筛选出含重组质粒的受体菌，受体细胞中应不含标记基因抗四环素基因。由于所有生物共
15、用一套遗传密码子，所以目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质。答案（1）鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸（2）BD（3）B和C8（4）Pst 、EcoR 1（5）抗四环素各种生物共用一套遗传密码子课后加强训练（时间：20分钟）1.（2016全国卷，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分
16、别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_ _（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且和的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有的固体培养基。（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。解析（1）作为
17、运载体必须具备如下特点：能自主复制，从而在受体细胞中稳定保存；含标记基因，以供重组DNA的鉴定和筛选；具一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入。（2）在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，不能在培养基中生长，而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生长。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分。（3）噬菌体是病毒，无细胞结构，无法
18、自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。答案（1）能自我复制、具有标记基因（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素（3）受体细胞2.（2018盐城三模）薄荷可产生蚜虫报警信息素EF，用于驱散蚜虫并吸引蚜虫的天敌。通过基因工程可制备含EF合成酶基因的转基因抗蚜麦。请回答问题：（1）薄荷利用EF驱散蚜虫并吸引蚜虫的天敌，体现了生态系统的信息传递具有， 维持生态系统稳定性的功能。（2）若利用PCR技术获取EF合成酶基因，在PCR反应体系中需加入、模板序列、原料及
19、两种。如果提取到薄荷细胞中EF合成酶的mRNA，则可用法获取目的基因。 （3）研究者利用4种限制酶切割目的基因和质粒，各限制酶的识别序列和切割位点如下图所示。酶切后的产物连接时，目的基因上Sal 切割产生的末端应与质粒上切割产生的末端相连接。连接完成后，该连接点（选填“能”或“不能”）被这两种限制酶中的某一种切割。 （4）欲从个体水平上检测转基因抗蚜麦是否培育成功，在小麦叶片上接种蚜虫后，通过观察叶片上蚜虫的或作为判定的依据。 （5）下列属于转基因抗蚜麦推广种植后引发的安全性问题的是（多选）。 A.小麦不再感染蚜虫B.目的基因向其他生物扩散C.减少杀虫剂对环境的破坏D.改变现有生态结构解析（1
20、）EF属于化学信息，薄荷利用EF驱散蚜虫并吸引蚜虫的天敌，体现了生态系统的信息传递具有调节生物种间关系， 以维持生态系统稳定性的功能。（2）PCR反应体系中需加入Taq酶、模板序列（EF合成酶基因）、4种脱氧核苷酸及两种引物。利用mRNA可以通过反转录法获取目的基因。（3）目的基因上Sal 切割产生的末端为，质粒上Xho 切割产生的末端也为，两者黏性末端相同，可以连接，连接点的碱基序列变为，不是两种限制酶的识别序列，不能被这两种限制酶中的某一种切割。答案（1）调节生物的种间关系（2）（耐高温的）DNA聚合酶（或Taq酶）引物反转录（3）Xho不能（4）停留时间天敌数量（5）BD3.嗜热菌可以生
21、活在98 的高温环境中，研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关。下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程，其中Nde、EcoR、Hind、Sal四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CATATG、GAATTC、AAGCTT、GTCGAC。请分析回答：（1）图中的结构A是，其主要作用是。一个完整的基因表达载体组成，除了质粒1中所示结构以外，还应该含有_。（2）用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用两种限制酶进行切割，影响限制酶处理效果的因素可能有（多选）。反应温度缓冲液pH限制酶的浓度DNA样品的纯度（3）PCR反应中引物的设计非常关键，据图分析，扩增H基因时应选择的一对引物是
22、。（多选）A.引物：GGGAATTC；引物：CTCATATGB.引物：GAATTCCC；引物：CATATGAGC.引物：GGAAGCTT；引物：AAGCTTCCD.引物：CTCATATG；引物：AAGCTTAAGCTT解析（1）据题图分析，由质粒1的结构及质粒1和重组质粒上都具有A可推知，A是启动子，其作用是提供RNA聚合酶特异性识别结合位点，驱动基因转录。一个完整的基因表达载体组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因，而质粒1中已经含有启动子和标记基因（抗生素A抗性基因），故答案是目的基因、终止子。（2）结合四种限制酶的识别序列和酶切位点，确定用图中质粒1和H基因构建重组质粒，应选用Nde
23、 、EcoR 两种限制酶进行切割，影响酶的因素都影响限制酶的处理效果，所以可能有温度、pH、酶浓度和底物的纯度，即。（3）分析切割质粒和目的基因的两种限制酶Nde、EcoR的识别序列和切割位点，发现A、B选项的引物中有Nde的识别序列CATATG，而A、B选项的引物中都有EcoR的识别序列GAATTC，而C、D中都不含，所以应选择A、B。答案（1）启动子提供RNA聚合酶特异性识别结合位点目的基因、终止子（和复制原点）（2）Nde、EcoR（3）AB4.（2018苏锡常镇三模）基因工程中，GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物，GFP基因会产生绿色荧光蛋白，这两种基因都可作为标记基因来研究发
24、育生物学的问题。利用双CRISPR/Cas9系统和Cre/loxP重组酶系统技术可更好地实现该研究。请据图作答：（1）图1为双CRISPR/Cas9系统作用示意图。该系统能够特异性识别DNA序列并切割特定位点的原因分别是、。图中向导RNA与DNA结合的原理是。将删除区切割后，转入基因与原DNA片段可通过形成拼接起来，形成新的DNA序列。 （2）双CRISPR/Cas9系统可直接在靶细胞内起作用，与传统的基因工程相比，该操作无需（填工具）。与质粒载体导入外源基因比，双CRISPR/Cas9系统编辑的基因可以不含。 （3）图2为Cre/loxP重组酶系统作用示意图。利用双CRISPR/Cas9系统
25、可精准地将loxP序列、GUS基因及GFP基因连接，接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区，这是由于基因自身无启动子而无法表达。Cre基因是重组酶基因，经38 热处理后可被激活表达，在此前提下组织中可检测出绿色荧光区，据此分析绿色荧光区形成的原因是。采用等技术手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积。 解析（1）图1中向导RNA有识别序列，能识别特定序列，Cas9 蛋白能定点切割DNA序列，所以该系统能够特异性识别DNA序列并切割特定位点。图中向导RNA可以与DNA发生碱基互补配对而结合。切割删除区后，转入的基因与原DNA片段可形成磷酸二酯键拼接成新的DNA序列。（2）传统的基因工
26、程需要载体将目的基因导入受体细胞，而双CRISPR/Cas9系统可直接在靶细胞内起作用，不需要载体。质粒载体导入外源基因需要含启动子、终止子和标记基因，而双CRISPR/Cas9系统编辑的基因不需要载体，可以不含启动子、终止子和标记基因。（3）loxP序列、GUS基因及GFP基因连接，接上35S启动子之后，GUS基因可以转录从而编码出酶将无色底物生成蓝色产物，而GFP基因自身无启动子无法表达绿色荧光蛋白，所以在组织中可以检测出蓝色区而无绿色荧光区。经38 热处理后Cre重组酶基因被激活表达，特异性识别切割 loxP 序列，使GFP基因接上35S启动子得以表达，组织中可检测出绿色荧光区，所以延长热处理时间可以扩大组织中绿色荧光区的面积。答案（1）向导RNA能识别特定序列Cas9 蛋白能定点切割DNA序列碱基互补配对磷酸二酯键（2）载体启动子、终止子和标记基因（3）GFP重组酶能（特异性识别并）切割 loxP 序列，使GFP基因得以表达延长热处理时间