1、重点题型1目标微生物的筛选与鉴定1.分离微生物的原理与措施（1）原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的微生物与其他微生物分离，再给该微生物提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。（2）常用措施接种过程中尽量使微生物分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。2.选择培养基四种常见制备方法或实例【例证】 （2017全国卷，37）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原
2、因是前者能产生。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_（答出两点即可）。（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是_。（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_（答出两点即可）。解析（1）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。能分解尿素的细菌是一种分解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作
3、用是：一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3不能起到筛选作用。（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用：KH2PO4和Na2HPO4构成缓冲液，可维持培养基的pH相对稳定；KH2PO4和Na2HPO4能为微生物生长提供无机盐离子。答案（1）脲酶分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物为细胞生命活动提供能量，为其他有机物
4、的合成提供原料（2）尿素其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用（3）为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。实验步骤：把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面，进行培养。待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基2上，随即再影印到含有链霉素的培养基3上，进行培养。在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落，将其挑选出。请回答：（1）配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、的要求。（2）从功能上看，含有链
5、霉素的培养基属于培养基。若在培养基中加入伊红和美蓝，则培养皿中长出的菌落颜色为。由图可知，1号培养基接种的方法为_。（3）对2和3进行比较，在2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到（填“含链霉素”或“不含链霉素”）的培养基上，如果有较多的菌落出现，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之（填“前”或“后”）。（4）3中的菌落比1、2中的菌落少很多，这说明了基因突变具有的特点。解析（1）配制培养基时在提供几种基本营养条件的基础上，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。（2）链霉素是抗生素，对大肠杆菌具有选择作用。在伊红和美蓝培养基上.大肠杆菌菌落颜色为黑色。由题图可知
6、，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。（3）培养基2和培养基3上相同的菌落，是具有相同性状的大肠杆菌形成的，将培养基2中一个相应菌落接种到含链霉素的培养基上，若出现较多的菌落，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。（4）抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状.3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明了基因突变频率很低。答案（1）pH氧气（2）选择黑色稀释涂布平板法（3）含链霉素前（4）频率低/低频性影印法接种的具体过程是：将待测的浓缩菌悬液涂在合适的平板上，等其长好后作为母平板（每个平板上的菌落控制在30300个）；用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上
7、，构成印章（即接种工具）；然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下；再把此印章在另一含有选择培养基的平板上轻轻印一下，经培养后，选择培养基平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较影印平板与母平板上菌落生长情况，即可从相应位置的母平板上选出待测的突变型菌落。影印法最初是为证明微生物的抗药性突变是自发的、与相应的环境因素无关而设计的接种方法，目前已广泛应用于营养缺陷型微生物的筛选以及抗药性菌株筛选等研究工作中。重点题型2微生物的分离与计数微生物计数的方法专项归纳1.间接计数法（也叫活菌计数法）常用的是稀释涂布平板法。（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来
8、源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。（2）操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，选择三个稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。计算公式：每克样品中的细菌数（C/V）M，其中C代表某一稀释度下平板上生
9、长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。提醒此种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。2.显微镜直接计数法（1）原理：利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定面积（1 mm2）和高（0.1 mm）的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由400个小格组成的。（2）操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴
10、在计数板上，稍等片刻，待细菌全部沉降到计数室底部再在显微镜下统计45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。（3）计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。 3.滤膜法以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例，将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。【例证】 （2018经典高考）酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研
11、究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题：（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的，及时对培养基进行分装，并进行灭菌。（2）取步骤中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤中将温度约（在25 、50 或80 中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤所示进行划线。下列叙述合理的有。a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量d.可以通过逐步提
12、高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株（4）步骤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用2516型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上色细胞的个数应不少于，才能达到每毫升3109个活细胞的预期密度。解析（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称取各组分，之后溶解定容，再调节培养基的pH，一般情况下，采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。（2）对培养基进行高压蒸汽灭菌后，需将温度降至50 左右后倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。（3）在对酵母菌进行划线纯化时，为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必
13、须灭菌；且在划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落；本实验是为了获得能以工业废甲醇作为碳源的酵母，故在实验过程中可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇耐受株。（4）酵母菌是兼性厌氧型真菌，有氧条件下大量繁殖。酵母菌扩大培养时，需保证充足的营养和氧气供应。“用等体积台盼蓝染液染色”，即计数室中培养液体积实际只有0.120.05 mm3，设5个中方格中无色（活细胞不被台盼蓝染色）的细胞数目为x个，则3109x/5251 0001 0000.05，解得x30。答案（1）pH高压蒸汽（湿热）（2）50 （3）a、b、d（4）氧气无30为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样
14、中的细菌含量，并进行了细菌分离和培养等工作。回答下列问题：（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，；然后，将1 mL水样稀释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为。（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过灭菌，为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落，在第二次及以后的划线时，一定要。示意图A和B中，表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。通常，对获得的纯菌种可以依据对细菌进行初步的鉴定和分类。（3）该
15、小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高的利用率。解析（1）为了确定培养基的灭菌是否合格，可以随机取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。由题意知1 mL水样中的菌落数是（393837）30.11 0003.8105，每升水样中的活菌数为3.81051033.8108。（2）接种环用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是：通过划线次数的增加，将聚集的菌体
16、逐渐稀释分散，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便获得由单个细胞繁殖而来的单个菌落。图A是用平板划线法接种培养后得到的结果，图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。可以依据菌落的形状、大小等特征对细菌进行初步的鉴定和分类。（3）振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量，促进好氧型微生物的生长；同时还能使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。答案（1）随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间3.8108（2）灼烧从上一次划线的末端开始划线B落菌的形状、大小等菌落特征（3）溶解氧营养物质课后加强训练（时间：15分钟）1.（2019河南名校联盟调研）如图所示为从土壤中分离、纯化和扩大培
17、养某种微生物的流程图。回答下列问题：（1）称量土样时，土壤（填“需要”或“不需要”）进行消毒和灭菌。（2）进行梯度稀释操作时，若待稀释菌液取1 mL，注入9 mL的无菌水，则该1 mL待稀释菌液被稀释了倍。（3）平板浇注法分离指的是将1 mL稀释的样品放于空白的无菌培养皿之后，将冷却到4550 的培养基倒入，轻摇混匀、凝固，然后放于恒温箱中培养。从土壤中分离酵母菌和醋酸菌时，可以使用平板浇注法的是，理由是_。（4）划线纯化阶段，对图示培养皿进行划线时接种环取菌液次，该培养皿划线完成时接种环共需进行灼烧灭菌次。（5）扩大培养阶段，所用培养基是（填“液体”或“固体”）培养基。解析根据平板浇注法的定
18、义可知，适合该方法分离的微生物应该是兼性厌氧型生物，而酵母菌符合该条件。答案（1）不需要（2）10（3）酵母菌平板浇注会使部分菌体埋入培养基中，酵母菌是兼性厌氧型生物，可以在低氧甚至无氧环境下生存繁殖（4）16（5）液体2.（2018山东菏泽一模）为探究大肠杆菌CV101菌株和CV103菌株的营养需求，某团队在营养成分相同的含醋酸盐的培养液中分别接种CV101菌株和CV103菌株，并置于相同且适宜的环境中培养，每隔一段时间统计两种菌株的生长状况。实验数据如下图所示，回答下列问题：（1）醋酸盐培养基从物理性质上来看属于培养基，该培养基主要应用是；从功能上来看属于培养基。（2）由图可知：更适应醋酸
19、盐培养基环境的菌株是，其依据是_，原因是_。（3）若要统计培养30小时后醋酸盐培养基中的CV101活菌数，可采用法；为保证能在固体培养基上获得单个菌落，接种前，需取1 mL该菌液进行处理。解析（1）根据题干信息分析，某团队在营养成分相同的含醋酸盐的培养液中分别接种CV101菌株和CV103菌株，因此该培养基属于液体培养基，有利于菌种的扩大培养；从功能上看其属于选择培养基。（2）据图分析可知，在一定时间内，CV101菌株在该培养基中数量持续增多，而CV103菌株的数量减少且维持在较低水平，说明CV101菌株能以醋酸盐为碳源，因此CV101菌株是更适应醋酸盐培养基环境的菌株。（3）常用的微生物接种
20、方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其中后者可以用于菌种的计数；为保证能在固体培养基上获得单个菌落，接种前，需取1 mL该菌液进行梯度稀释处理。答案（1）液体扩大培养选择（2）CV101菌株在一定时间内，CV101菌株在该培养基中数量持续增多，而CV103菌株的数量减少且维持在较低水平CV101菌株能以醋酸盐为碳源（3）稀释涂布平板梯度稀释3.（2018开封市高三定位考试）烧伤病人容易感染绿脓杆菌，引起化脓性感染。比阿培南、美罗培南、头孢菌素和碳青霉烯类抗生素都是非常经典的抗绿脓杆菌的药物。临床使用时，有时需要做细菌耐药实验。实验时，从病人身上获取少量样本，按下列一定的实验步骤操作，以确定病人体
21、内的绿脓杆菌对不同抗生素的敏感性。（1）获取绿脓杆菌单菌落配制培养基。主要步骤是计算称量溶化分装倒平板。图2所示接种方法为法，这种方法的主要目的是使接种物。图1的操作中，第一次划线前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染，第二次及之后的几次划线前灼烧接种环的目的是。在图2所示操作前，需要随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目的是。（2）检测绿脓杆菌对不同抗生素的敏感度绿脓杆菌对不同抗生素的敏感度的对比、对照实验结果如图3所示：在恒温箱培养3天后，培养基上有绿脓杆菌滋生，且除浸有无菌水的圆纸片外，其他浸有美罗培南、比阿培南、头孢菌素或碳青霉烯类抗生素的圆纸片周围都出现了抑菌环。如果你是医
22、生，建议患者最好选用抗生素，判断的理由是_。（3）菌种保藏将分离纯化后的菌株接种到上，在适宜条件下培养。当菌落长成后，将试管置于4 冰箱中保藏待用。（4）常采用法统计活菌数目直接从静置的培养液中取样计数的做法是错误的，正确的操作是_。答案（1）调pH和灭菌平板划线逐步稀释（以便获得单个菌落）杀死上次划线后接种环上残留的菌种（使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端）检测培养基平板灭菌是否合格（2）美罗培南抑菌圈最大，说明对绿脓杆菌的杀伤效果最好（3）固体斜面培养基（4）稀释涂布平板法将培养液摇匀后取样计数4.（2019焦作市新高三定位考试）某环保部门为了检测饮用水是否被大肠杆菌污
23、染，进行了相关实验。如图是检测大肠杆菌的流程，请回答下列问题：（1）培养大肠杆菌的培养基一般除含有碳源、氮源外，还要有微生物生长所需要的；对培养基常采用法灭菌；培养基宜将pH调节至。（2）最常用的两种接种方法是和，在培养过程中需要随机取若干灭菌后的空平板先行培养一段时间，这样做的目的是_。（3）若用图示方法统计大肠杆菌数量，则理论上统计值比实际值。（4）国家生活饮用水卫生标准规定：接种1 mL水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，经37 、24 h培养后，所生长出的菌落总数不得大于100。为了了解某种水是否符合饮用水卫生标准，某检测部门取10 mL水样按图示和要求操作，结果如下表：平板1平板2平板3
24、菌落数/个370350380据上表结果判断，所取水样测定结果（填“符合”或“不符合”）饮用水的卫生标准。解析（1）培养基中一般除含有碳源、氮源外，还应含有水和无机盐，微生物培养过程中要注意防止杂菌污染，培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，培养细菌的培养基宜将pH调至中性或微碱性。（2）常用的纯化微生物的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，为了检测培养基的配制（灭菌）是否合格，在培养过程中需要随机取若干灭菌后的空平板先行培养一段时间。（3）两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此该方法统计大肠杆菌数量时，理论上统计值比实际值偏低。（4）表格中3个平板的平均菌落数为367个，则1 mL水样中的菌落数为36.7个，低于国家规定的标准，因此所取水样符合饮用水的卫生标准。答案（1）水和无机盐高压蒸汽灭菌中性或微碱性（2）平板划线法稀释涂布平板法（两空顺序可颠倒）检测培养基的配制（灭菌）是否合格（3）偏低（或偏小）（4）符合