1、益气活血解毒方治疗晚期上皮性卵巢癌疗效相关靶基因筛选李娟 翁洁琼 卢雯平摘要：目的采用 mRNA 芯片探究益氣活血解毒方维持治疗晚期上皮性卵巢癌（AEOC）气虚血瘀证疗效相关基因靶点，明确其有效作用机制。方法观察 AEOC 气虚血瘀证患者服用益气活血解毒方维持治疗后的无进展生存期（PFS），选取 PFS 最长的 8 例为敏感组，PFS 最短的 8 例为不敏感组。采用 mRNA 芯片检测 2 组患者治疗后血液 mRNA 表达情况，并对差异表达基因进行 GO、KEGG、singal-net、path-net 生物信息学分析，实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）验证。结果益气活血解毒方疗效相关差异
2、表达基因共 1157个（P0.05），其中上调基因 497 个，下调基因 660 个。qRT-PCR 显示，MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3 差异表达有统计学意义（P0.05）。结论益气活血解毒方治疗AEOC 气虚血瘀证患者的疗效机制可能在于抑制 MAPK3 及与免疫通路相关的 HLA-DOA、CD40、KIR2DL3 靶基因。通过对益气活血解毒方作用靶基因的探究，可为 AEOC 气虚血瘀证微观辨证及中医精准治疗提供依据。关键词：晚期上皮性卵巢癌;mRNA 芯片;益气活血解毒方;气虚血瘀证;靶基因中图分类号：R273.731文献标识码：A文章编号：1005-5304（202
3、0）04-0028-07DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201910465Screening of Target Genes Related to Efficacy of Yiqi Huoxue JieduDecoctionfor Advanced Epithelial Ovarian CancerLI Juan，WENG Jieqiong，LU WenpingGuanganmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100053，ChinaAbstract：Objective To ex
4、plore the gene targets related to efficacy of Yiqi Huoxue JieduDecoction for maintenance treatment of advanced epithelial ovarian cancer（AEOC）with qi deficiency and blood stasis syndrome using mRNA chip;Toclarify effective mechanism.Methods Progression-free survival（PFS）of theAEOC patients with qi d
5、eficiency and blood stasis syndrome after taking YiqiHuoxue Jiedu Decoction for maintenance treatment was observed，and 8 caseswith the longest PFS（sensitive group）and 8 cases with the shortest PFS（insensitive group）were selected.Application of mRNA chip was used todetection the expression of mRNA in
6、 patients blood of two groups.Anddifferentially expressed genes were analyzed by gene ontology，KEGG，singal-net，path-net bioinformatics analysis，and real-time fluorescencequantitative PCR（qRT-PCR）for verification.Results Totally 1157differentially expressed genes related to efficacy of Yiqi Huoxue Ji
7、eduDecoction were screened out，of which 497 up-regulated genes and 660 down-regulated genes.qRT-PCR results showed that there was statisticalsignificance in MAPK3，HLA-DOA，CD40 and KIR2DL3（P0.05）.Conclusion Itis found that inhibition of MAPK3 pathway and co-regulating HLA-DOA，CD40 andKIR2DL3 related
8、immune pathways may be an effective mechanism for Yiqi HuoxueJiedu Decoction to treat AEOC patients with qi deficiency and blood stasissyndrome.The exploration of the target genes of Yiqi Huoxue Jiedu Decoctioncan provide the basis for the microscopic syndrome differentiation of AEOCwith qi deficien
9、cy and blood stasis syndrome and the accurate treatment of TCM.Keywords：advanced epithelial ovarian cancer;mRNA chip;Yiqi Huoxue Jiedu Decoction;qideficiency and blood stasis syndrome;target genes卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，75%的卵巢癌在诊断时已为晚期1-2。尽管抗血管生成药物和聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶抑制剂已应用于卵巢癌的维持治疗中，并显示出一定效果，但 5 年生存率仍不足 40%，且因价
10、格昂贵和伴随高血压及贫血等不良反应，限制了其临床应用3。探究卵巢癌的生物学特点并寻找低毒价廉的维持治疗方法已成为临床迫切需要解决的问题4。中医药在卵巢癌维持治疗中应用广泛。益气活血解毒方是我们在张锡纯理冲汤基础上加减而成，前瞻及真实世界的临床研究均显示其对晚期上皮性卵巢癌（advancedepithelial ovarian cancer，AEOC）的维持用药可延长患者无进展生存期（PFS），提高生活质量，但有效作用机制尚未明确5-6。本研究采用人基因表达谱芯片，分析益气活血解毒方治疗 AEOC 气虚血瘀证敏感人群与不敏感人群的差异表达基因，进行生物信息学分析并验证，探究益气活血解毒方治疗 A
11、EOC 气虚血瘀证疗效相关的基因靶点。现报道如下。1资料与方法1.1一般资料选择 2015 年 3 月-2016 年 12 月中国中医科学院广安门医院肿瘤科门诊经益气活血解毒方维持治疗的 AEOC 患者 300 例，随访至 2018 年 12 月。PFS 为 345 个月，服药时间（24.01.6）月。选取 PFS 最长的 8 例为敏感组，PFS 最短的 8 例为不敏感组。由于不敏感组 1 例血液样本 mRNA 检测时不符合 Affymetrix 的官方芯片质检标准而排除，故为 87行疗效相关差异基因分析。2 组 PFS 比较差异有统计学意义（P0.05），具有可比性，见表 1。本研究经中国中
12、医科学院广安门医院伦理委员会审查批准（2014EC035）。1.2西医诊断标准参照中国常见恶性肿瘤诊治规范7，根据症状、体征、影像学检查，并经细胞学和/或组织学检查确认，选取C/期的 AEOC 患者。分期采用 2014 年国际妇产科联盟（FIGO）分期8。1.3中医辨证标准参照中药新药临床研究指导原则（试行）9制定气虚血瘀证辨证标准。症见乏力，气短，疼痛，肤色晦黯;舌脉：舌黯，有瘀斑，舌下静脉青紫，舌苔薄白或有齿痕，脉弱而涩。1.4纳入标准符合上述西医诊断标准及中医辨证标准;年龄 1880 岁;完成减瘤术未超过 6个月;完成 68 个周期的铂类加紫杉醇类化疗未超过 1 个月;患者对本研究知情，
13、并签署知情同意书。1.5治疗方法患者均予益气活血解毒方，药物组成：黄芪 30 g，女贞子 15 g，枸杞子 15 g，白术15 g，山药 15 g，三棱 6 g，莪术 9 g，青皮 6 g，乌药 6 g，肉桂 6 g，白花蛇舌草 15g，青蒿 12 g。饮片由中国中医科学院广安门医院药房提供。每日 1 剂，水煎取汁 300mL，早晚各 1 次口服。服药半年后（若半年内疾病进展则在进展时进行）抽取外周血 1015 mL，采用 mRNA 提取试剂盒提取 mRNA 后保存。每 3 个月随访 1 次，随访至疾病进展或至 2018 年 12 月研究结束。1.6mRNA 提取及芯片检测采用 IANGEN
14、RNAprepPure 血液总 RNA 提取试剂盒从患者外周血样中提取总 RNA，使用GeneChip 3 IVT PLUS Reagent Kit 将总 RNA 制备为纯化 aRNA，并将其片段化后与GeneChip?PrimeViewTM Human Gene Expression Array 芯片探针杂交、洗染、扫描等得到图片和原始数据，筛选 P1.2 的基因為差异表达基因。1.7生物信息学分析为全面直观地展示 2 组基因表达的关系及差异，将差异表达基因做无监督层次聚类分析，以热图形式显示。应用基因本体论（GO）分析差异表达基因的主要功能，GO 分析根据差异表达基因的分子功能和生物过程将
15、基因分为不同层次类别，以揭示差异表达基因调控网络10。利用京都基因与基因组百科全书（KEGG），分析差异表达基因的显著通路11。根据 KEGG 数据库中信号通路的上下游关系，建立各通路间的相互作用网络（path-net）分析12。基于 GO 和 KEGG 分析，建立全局信号转导网络（signal-net）分析差异表达基因间的相互作用，以分析得到核心关键基因13。1.8实时荧光定量 PCR实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）采用 Trizol 试剂（Life Technologies）从血液样本中分离总 RNA，用反转录试剂盒（Takara）转录至 cDNA。采用 SYBR Green 试剂（
16、Bio-Rad）平行测定 3 次。采用 2-Ct 法通过相对定量方法比较 2 组 mRNA 表达量。1.9统计学方法采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。计量资料以xs 表示，2 组 PFS 比较采用非参数估计（Mann-Whitney U 检验）;计数资料采用卡方检验，2 组一般资料比较采用 Fisher确切概率法;等级资料采用秩和检验。P0.05 表示差异有统计学意义。2结果2.1疗效相关差异表达基因及聚类分析经益气活血解毒方治疗，2 组 mRNA 芯片检测得到差异表达基因 1157 个，其中上调基因 497 个，下调基因 660 个。聚类图见图 1。2.2疗效相关差异表达基因基因本体
17、论分析对疗效相关差异表达基因行 GO 分析。前 10 个上调基因涉及核转录 mRNA 分解代谢过程，SRP 依赖的共翻译蛋白靶向膜，核糖体 RNA 加工，病毒转录，平移起始，淀粉样前体蛋白生物合成过程的监管，气管腺体发育，翻译，基因表达，B 细胞增殖，详见表 2。前 10 个下调基因涉及嗜中性粒细胞脱颗粒，消化丝氨酸磷酸化，RNA 聚合酶启动子转录的正调控，细胞内信号转导，脂肪垫的开发，GTPase 活性的正调控，受体活性的正调控，细胞对缺氧的反应，毛囊成熟，细胞脂代谢过程，详见表 3。2.3疗效相关差异表达基因的京都基因与基因组百科全书分析对疗效相关差异表达基因行 KEGG 分析。前 10
18、个上调的通路涉及同种异体移植排斥，自身免疫性甲状腺疾病，B 细胞受体信号通路，造血细胞谱系，抗原处理及呈递，EB 病毒感染，病毒性心肌炎，核糖体，移植物抗宿主病，型糖尿病，详见表 4。前 10 个下调的通路涉及 MAPK 信号通路，调节肌动蛋白细胞骨架，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药，癌症蛋白聚糖，黏着斑，促性腺激素信号通路，补体和凝血级联，T 细胞受体信号通路，Rap1 信号通路，FoxO 信号通路，详见表 5。2.4相互作用网络分析疗效相关差异表达基因触发的核心通路基于显著差异通路的数据，path-net 分析揭示了益气活血解毒方治疗后疗效相关的核心通路。Degree10 的核心通路
19、及上下调情况为 MAPK 信号通路下调，T 细胞受体信号通路下调，肌动蛋白细胞骨架的调节下调，抗原处理及呈递上调，补体和凝血级联下调，B细胞受体信号通路上调，细胞黏附分子上调，癌症通路下调。信号通路的度越高，说明其受到其他通路的调控或被其他通路调控，其在信号网络中的作用越重要。见表 6、图 2。2.5疗效相关差异表达基因触发的核心基因根据差异表达基因显著的 GO 功能和 KEGG 通路富集，signal-net 分析揭示了该方维持治疗差异疗效的核心基因。在 signal-net 中获得了 120 个关键基因，更高的度表明这些基因与其他基因具有很强相关性，它们在信号网络中发挥着更重要的作用。见图
20、 3。Degree6 的核心基因是 MAPK3，AKT3，MAPK13，MAPK14，CTNNB1，FOXO3，MYC，GNG12，ENTPD1，PPP2R1B。见表 7。2.6实时荧光定量 PCR 验证对 2 组患者行 qRT-PCR 验证可能的靶基因，与不敏感组比较，敏感组 MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3 的基因表达明显降低，差异有统计学意义（P0.05）。見表 8。3讨论卵巢癌致死率高，精准治疗是未来趋势。前期临床研究表明，益气活血解毒方维持治疗 AEOC 气虚血瘀证可提高 PFS，但相同证型的患者中药治疗后的 PFS 不尽相同，证型与体质密切相关，体质禀于先天、关
21、于后天14-16。本研究从 mRNA 角度探讨益气活血解毒方的有效机制，通过探究治疗优势人群作用靶基因，为 AEOC 气虚血瘀证微观辨证及中医精准治疗提供依据。本研究通过 mRNA 芯片检测益气活血解毒方维持治疗 2 组的差异表达基因并分析验证，得到一些可能的靶基因。益气活血解毒方敏感组自然杀伤细胞抑制性受体 KIR2DL3 下调，提示该方可能通过下调 KIR2DL3 发挥抗肿瘤作用。KIR2DL3 是自然杀伤细胞的 KIR 抑制性受体，阻断自然杀伤细胞抑制性 KIR 受体与肿瘤细胞 KIR 配体间的结合，有助于恢复自然杀伤细胞抗肿瘤作用，此为自然杀伤细胞免疫检查点阻断疗法的理论依据。MD 安
22、德森癌症中心发起的抗 KIR药物 Lirilumab 治疗骨髓异常增生综合症研究显示安全性和有效性良好17。本研究中，敏感组患者 KIR2DL3 明显下调，只有不敏感组的 60%，说明益气活血解毒方可通过下调KIR2DL3 释放肿瘤微环境中的免疫刹车，促进自然杀伤细胞的抗肿瘤作用。本研究显示，敏感组 HLA-DOA 表达下调，抗原处理及呈递通路上调。人类白细胞抗原DM（HLA-DM）可对肿瘤抗原肽编辑以便被 CD4+T 细胞识别，DO 分子对 HLA-DM 分子功能有负向调节作用，HLA-DOA 表达水平可以反映机体抗肿瘤免疫监视的强弱18。提示益气活血解毒方可能是通过提高肿瘤微环境中抗原呈递
23、能力，如下调 HLA-DOA、上调 HLA-DM，以上调 CD4+T 细胞表达，进而提高抗肿瘤免疫效应。本研究发现，敏感组 CD40 的表达下调，对患者的生存起正面影响。CD40 是肿瘤坏死因子受体（TNF-R）超家族成员，对肿瘤细胞具有促增殖和促凋亡的双重作用，可促进肿瘤血管生成和肿瘤扩散19-20，作为免疫应答中的共刺激分子提高免疫识别，增强机体抗肿瘤免疫反应21-22，可与 CD4+T 细胞结合，促进 T 细胞活化23，CD40 的双重作用可能导致它在肿瘤生长和抑制中的角色较为复杂。Qu 等24发现，CD40 可诱导卵巢癌细胞迁移。故益气活血解毒方可能通过下调 CD40 延长卵巢癌患者的
24、生存期。CD40 在促进 T细胞活化的缺失，可由其他刺激因子弥补，如上述 HLA-DOA 的下调机制。本研究显示，敏感组 MAPK 通路下调，ERK1（MAPK3）基因下调。MAPK 通路异常激活能导致肿瘤发生，越来越多的证据表明，MAPK 通路可以促进肿瘤微环境的免疫抑制，抵抗免疫疗法25。抑制 MAPK 通路可显著提高免疫疗法的疗效，主要通过增强肿瘤细胞的抗原呈递、增强 MHC-表达、抑制 Tregs 扩增等途径，MAPK 通路抑制剂联合免疫疗法是肿瘤治疗的新方向26，目前正在进行的几项免疫检查点抑制剂联合 MAPK 通路抑制剂的临床试验早期结果显示，对肿瘤生长有协同抑制作用，对患者生存有
25、益27-28。细胞外调节蛋白激酶（ERK）是 MAPK 通路的中心成员，MAPK/ERK 通路异常活化是控制 85%以上的人类癌症细胞增殖、转移和耐药的关键29-30。表明该通路和基因可能是益气活血解毒方的有效靶点。我们利用预测生存和预后价值的 Kaplan-Meier Plotter 数据库分析 MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3 与/期 AEOC 患者 PFS 之间的关系31。结果提示，MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3 的 mRNA 表达为危险因素，其表达越低，患者预后越好。综上，益气活血解毒方治疗 AEOC 气虚血瘀证患者的机制可能在于抑制 MAPK
26、 通路，协同调节 HLA-DOA、CD40、KIR2DL3 相关免疫通路，以提高抗原呈递，增强抗肿瘤免疫反应;益气活血解毒方治疗的优势人群可能为对 MAPK3、HLA-DOA、CD40、KIR2DL3 敏感的人群;通过对益气活血解毒方治疗优势人群作用靶基因的探究，可为 AEOC 气虚血瘀证微观辨证及中医精准治疗提供依据。本研究为中医药有效机制探讨提供了新思路。但只检测了中药治疗后患者 mRNA 表达水平，未检测服药前后表达变化。下一步拟开展临床研究，检测益气活血解毒方维持治疗前后 HLA-DOA、CD40、KIR2DL3、MAPK3 基因的 mRNA 和蛋白表达，分析与患者生存的关系，进一步明
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