1、背根神经节脉冲射频对 CCI,模型大鼠机械性痛阈及相关炎性因子表达的影响蒋雨斌李平马旭杰王芬江仁李红摘要 目的 通過制备慢性坐骨神经缩窄损伤（CCI）模型，并对模型大鼠实施背根神经节（DRG）脉冲射频（PRF），探讨其对 SD 大鼠模型的干预效果及机制研究。方法 60 只雄性 SD 大鼠随机分为 4 组：假手术组（Sham）、CCI 组、CCI+PRF 组、CCI+假脉冲射频组（CCI+NPRF 组），每组 15 只。观察大鼠造模前及造模后 1、3、5、7d，脉冲射频后 1、7、14 d 的痛阈改变。造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，采用 ELISA 检测脊髓 SDF-1/CXCR4、
2、TRPV1 的表达;造模前、CCI-1 d、PRF-1 d 检测大鼠血清中 TNF-、IL-6 细胞因子变化。结果 与 Sham 组比，CCI 组、CCI+PRF 组、NPRF 组大鼠在神经损伤后右后爪 PWMT 和PWTL 均显著降低（P0.05），而脊髓 SDF-1/CXCR4、TRPV1 表达增强，大鼠血清 TNF-、IL-6 表达明显上升（P0.05）。PRF 治疗后 CCI+PRF 组大鼠机械性痛阈较其他三组显著升高（P0.05），但仍低于 Sham 组（P0.01），脊髓 SDF-1/CXCR4、TRPV1 表达则明显减少，同时血清中 TNF-、IL-6 表达明显下降（P0.05）
3、。结论 脉冲射频能有效减轻 CCI 模型大鼠的痛敏，其机制可能与抑制趋化因子 SDF-1/CXCR4、TRPV1 及调节 TNF-、IL-6 的表达有关。关键词 神经病理性疼痛;脉冲射频;背根神经节;炎性因子中图分类号 R402文献标识码 A文章编号1673-9701（2020）07-0023-05Impacts of dorsal root ganglion pulsed radiofrequency on paw withdrawalmechanical threshold and relevant inflammatory factors in chronic constrictioni
4、njury rat modelsJIANG Yubin1LI Ping1MA Xujie1WANG Fen2JIANGRen1LI Hong11.Department of Anesthesiology，Ningbo Yinzhou No.2 Hospital，Ningbo315100，China;2.Department of Anesthesiology，Ningbo Women andChildrens Hospital，Ningbo315012，ChinaAbstract Objective To investigate the therapeutic effects of dorsa
5、l rootganglion（DRG）pulsed radiofrequency（PRF）on chronic constriction injury（CCI）of sciatic nerve models in Sprague-Dawley（SD）rats，and elucidatethe mechanism behind it.Methods Sixty male SD rats were randomly divided into4 groups，namely the Sham group，the CCI group，the CCI+PRF group and theCCI+non-PR
6、F（NPRF）group，with 15 in each group.Paw withdrawal mechanicalthreshold（PWMT）and paw withdrawal thermal latency（PWTL）were detectedbefore modeling，at 1，3，5 and 7 days after modeling and at 1，7 and 14days after PRF.Stromal cell-derived factor-1（SDF-1）/CXCR4 ratio and thelevel of transient receptor poten
7、tial vanilloid-1（TRPV1）in the spinal cordwere determined before modeling，at 7 days after modeling and at 14 daysafter PRF using an ELISA assay.Serum levels of tumor necrosis factor-（TNF-）and interlukin-6（IL-6）were determined before modeling，at 1 day aftermodeling and at 1 day after PRF.Results After
8、 CCI modeling，PWMT and PWTL inthe right hind paw significantly decreased in the CCI，CCI+PRF and CCI+NPRFgroups，accompanied by an increased SDF-1/CXCR4 ratio and up-regulations ofTRPV1 in the spinal cord and TNF-and IL-6 in the serum compared with theSham group（P0.05）.PWMT significantly increased in
9、the CCI+PRF groupcompared with other three groups after treatment（P0.05），but stilldecreased compared with the Sham group（P0.01）.After PRF treatment，theSDF-1/CXCR4 ratio and TRPV1 expression in the spinal cord and serum levels ofTNF-and IL-6 significantly decreased in the CCI+PRF group（P0.05）.Conclus
10、ion PRF effectively ameliorated hyperalgesia in CCI rats.Theunderlying mechanism may associate with the repressed SDF-1/CXCR4 ratio andexpressions of TRPV1，TNF-and IL-6.Key words neuropathic pain;pulsed radiofrequency;dorsal root ganglion;inflammatory factors神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一种由神经系统原发性损害
11、和功能障碍所激发或引起的疼痛，具有自发性疼痛、痛觉过敏或超敏的特征1。Sluijter 等于 1997年首次提出脈冲射频（pulsed radio frequency，PRF）技术用于镇痛治疗，目前 PRF 已广泛用于治疗颈源性头痛、颈腰椎间盘退行性病变等多种慢性疼痛疾病2-4。尽管在许多研究中均表明 PRF 有明确的镇痛效果，但其镇痛机制还未完全明确。已知某些趋化因子可以增加背根神经节和脊髓神经元的兴奋性。其中基质细胞衍生因子 SDF-1（stromalcell-derived factor 1，SDF-1）又称为 CXCL12 属于趋化因子 CXC 类，CXCR4 是趋化因子基质细胞衍生因
12、子-1（CXCL12）的特异受体。Yang 等5研究发现，在 NP 模型大鼠的背根神经节和脊髓中均能检测到 SDF-1 和 CXCR4 上调。已知趋化因子诱导神经元兴奋性增加与瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道密切相关，TRP 通道拮抗剂能衰减神经源性、强直性和神经性疼痛的强烈反应。其中脊髓中瞬时感受器电位香草酸受体1（TRPV1）是位于外周及中枢系统的离子通道型受体，当被激活后导致离子通道开放，已经证明 TRPV1 在疼痛通路的突触传递中起着重要的作用。尤其是在病理性疼痛状态下，感觉神经元和间质神经元中央端 TRPV1 可能共同导致疼痛加重。
13、另外研究发现，在沉默脊髓TRPV1 基因的表达后，可通过抑制 CAMKII/ERK2 的激活减弱神经性疼痛的维持6。本实验选择 CCI 模型模拟临床神经病理性疼痛，并应用 DRG 脉冲射频，观察其对大鼠脊髓内 SDF-1/CXCR4 及 TRPV1 以及机械性痛阈的影响，探讨背根神经节 PRF 镇痛作用的可能机制。1 材料与方法1.1 实验材料健康雄性 SD 大鼠 60 只，体重（25030）g，清洁级，购自中国科学院上海实验动物中心。本研究经过地方实验动物伦理委员会批准通过。脉冲射频仪（Cosman RF-G4，美国）、22G 射频治疗套管针（Cosman RF-G4，美国）、Digital
14、 Von Frey 测痛仪（Stoelting 公司，美国）、全自动热痛刺激仪（PL-200 型，成都泰盟科技有限公司）、TRPV1 酶联免疫检测试剂盒购于上海双赢生物科技有限公司、SDF-1 和 CXCR4 试剂盒购于EIAab 公司、TNF-和 IL-6 试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。1.2 实验方法1.2.1 实验分组60 只 SD 大鼠适应性饲养 1 周后，随机分为 4 组：假手术组（Sham组）、慢性坐骨神经缩窄损伤组（CCI 组）、CCI+PRF 组、CCI+假脉冲射频组（CCI+NPRF组）。各组大鼠于术后 7 d 在术侧 L4-5 间隙 DRG 处行 360 s 的标准
15、PRF 治疗。CCI+NPRF组仅暴露在射频刺激针下，不予脉冲治疗。造模前，CCI 后 1 d、3 d、5 d、7 d，PRF 后1、7、14 d 四组大鼠均进行痛阈测定。造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，采用 ELISA 检测脊髓 SDF-1/CXCR4、TRPV1 的表达，造模前、CCI-1 d、PRF-1 d 检测大鼠血清 TNF-、IL-6细胞因子变化。1.2.2 模型制备采用 Bennett 等7的方法建立大鼠 CCI 模型：10%水合氯醛腹腔麻醉后俯卧位四肢固定，右侧后肢股骨处剃毛消毒，外科手术刀切开皮肤，并钝性剥离肌肉，暴露出坐骨神经干，利用 4.0 铬制肠线环绕神经干分
16、别做 4 个结扎环，间距 1 mm，观察到小腿部肌肉颤动为最佳结扎力度。术毕缝合消毒，单笼饲养。1.2.3 脉冲射频DRG 治疗方法制作 CCI 模型后 7 d，于大鼠腰 5 棘突旁右侧切开剥离，暴露 L4-5 横突及椎间孔，射频穿刺针尖沿与神经根走形平行方向轻柔置于 L4 和 L5椎间孔内进行阻抗测试，运动测试未引起相应节段脊神经支配的显著的下肢肌肉收缩运动，确认穿刺针针尖位于 DRG，位置正确后予 3 Hz 的频率和 20 ms/次的参数 42脉冲射频 360 s。手术后，注射青霉素以防止感染。1.2.4 机械刺激缩足反应痛阈值（paw withdrawal-mechanical thre
17、shold，PWMT）测量按 Chaplan 等8研究的方法，使用 Von Frey 纤维通过“上-下”法测量 PWMT。将不同压力的 Von Frey 纤维丝从底部垂直刺激大鼠右后足底中心持续 68 s，大鼠的抬高或跛足行为被认为是阳性反应，否则是负反应。每只大鼠测 3 次，每次间隔 10 min，取平均值。1.2.5 热刺激缩足反应潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）的测量将 PL-200 型自动热疼痛刺激仪温度设定为 50，每次适应 5 min 后将大鼠置于热疼痛刺激仪上，记录大鼠受热刺激后收缩反应热痛觉的指示作为热痛觉潜伏期。每只大鼠测3 次
18、，每次间隔 10 min，取平均值。1.2.6 ELISA 检测大鼠脊髓 SDF-1/CXCR4 及 TRPV1 含量变化造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，在麻醉状态下，外科手术迅速将大鼠脊髓 L4-5 节段取下，置于液氮反复冻融后匀浆，整个过程都在冰上进行，然后在 4、12000 转/min 离心 30 min，小心吸出上清液并储存在-80。按照 ELISA 实验操作及试剂盒说明进行测定。1.2.7 ELISA 检测大鼠血清 TNF-、IL-6 细胞因子变化造模前、CCI-1 d、PRF-1d，每组大鼠经颈静脉窦取血 2 mL，离心留取血清，按照 ELISA 实验操作及 TNF-、I
19、L-6试剂盒说明进行测定。1.3 统计学分析采用 SPSS 22.0 统计软件分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比较及组内比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P0.05），见表 1。CCI 术后除 Sham 组外，各组大鼠生长及饮食减少，但各组大鼠体重比较无明显差异。CCI 组均出现不同程度的右后肢步态跛行，下肢软弱无力，右后足外翻及肌肉萎缩等状态。CCI+PRF 组大鼠在脉冲射频后，上述症状明显改善，活动量明显增加。2.2 大鼠 PWMT 和 PWTL 测定比较（1）PWMT 的比较：CCI 前各组大鼠基础值比较无统计学差异。Sham 组术后各时间点PWMT 与术
20、前基础值相比，无明显统计学差异。造模后，CCI 组和 CCI+NPRF 组 PWMT 较术前明显降低，第 7 天至最低（P0.01）。CCI+PRF 组大鼠经脉冲射频后第 1、7、14 天，术后痛觉敏感度逐渐恢复，PWMT 较 CCI 组和 CCI+NPRF 组显著升高（P0.01），CCI+PRF 组PWMT 从（2.460.59）g（CCI-7 d）上升至（7.300.61）g（PRF-14 d）。见图 1A。（2）各组 PWTL 的比较：CCI 前各组大鼠基础值比较无统计学差异。Sham 组术后各时间点 PWTL 与术前基础值相比，无明显统计学差异。造模后，CCI 组和 CCI+NPRF
21、 组 PWTL 较术前明显降低，第 7 天至最低（P0.01）。脉冲射频后，CCI+PRF 组 PWTL 从（4.170.40）s（CCI-7 d）上升至（7.110.52）s（PRF-14 d），CCI+PRF 组大鼠经脉冲射频后，术后痛觉敏感度逐渐恢复，PWTL 较 CCI 组和 CCI+NPRF 组显著升高（P0.01）。见图 1B。2.3 大鼠脊髓中 SDF-1/CXCR4 及 TRPV1 含量检测造模前各组大鼠脊髓中趋化因子 SDF-1/CXCR4 含量及 TRPV1 含量几乎没有差异，且含量较低。CCI 术后 7 d，与 Sham 组比较，CCI 组、CCI+NPRF 组、CCI+
22、PRF 组表达显著增加（P0.05），但这三组两两比较无显著性差异。CCI+PRF 组大鼠经脉冲射频后 14 d 脊髓组织中 SDF-1/CXCR4 及 TRPV1 含量较 CCI 组和 CCI+NPRF 组显著降低（P0.05），但仍高于Sham 组（P0.05），见表 2。2.4 各组大鼠血清中细胞因子含量检测造模前各组大鼠血液中细胞因子 TNF-、IL-6 含量无明显差异。CCI 术后 1 d，与Sham 组比较，CCI 组、CCI+NPRF 组、CCI+PRF 组表达显著增加（P0.05），但这三组两两比较无显著性差异。CCI+PRF 组大鼠经脉冲射频后 1 d 血清中 TNF-、IL
23、-6 含量较 CCI 组和 CCI+NPRF 组显著降低（P0.05），见表 3。3 讨论NP 是一种慢性、顽固性疼痛，目前没有任何特殊的治疗，仅姑息治疗方法可用于暂时缓解症状，给患者造成巨大痛苦，严重影响患者的生存质量9。虽然 NP 的治疗目前仍是基于药物为主，长期增加剂量容易产生耐药性和严重的副作用，而镇痛效果不能得到保证。有研究证实，大鼠背根神经节脉冲射频能有效缓解神经病理性疼痛10-11。脉冲射频能刺激脉冲，从而使神经可不受进一步损伤并达到缓解疼痛的目的，所以其在临床中的应用日益广泛，包括用于治疗带状疱疹后神经痛、周围神经痛、难治性颈源性头痛等，但仍有较多问题有待进一步研究以增进临床疗
24、效2-4，12-15。NP 可由外周敏化或中枢敏化产生，当末梢神经受损时，伤害信息被发送并集成通过传入神经，然后通过脊髓、丘脑等传送，并且最终在大脑皮层形成疼痛。因此我们选择脊髓部位相关因子作为研究观察的切入点。Vallejo R 等16利用 SNL 模型，实验组给予 PRF3 min，24 h 后测定坐骨神经、DRG 和脊髓的炎性因子等表达，发现脉冲射频组不但能逆转 SNI 模型导致的痛觉过敏，而且与实验组相比，射频组坐骨神经炎性因子表达恢复到基础水平，包括 TNF-、IL-6，背根神经节 GABAB-R1、Na/K ATP、5-HT3 表达明显上升，同时 TNF-、IL-6 明显下降，脊髓
25、 Na/K ATP 和 c-Fos 上调。Liu Y 等17发现在 CCI 模型中，将射频电极放置于大鼠坐骨神经的结扎近端，与对照组相比，PRF 能显著提高 CCI 大鼠的热痛阈，逐渐降低痛觉过敏和痛觉超敏的比例。有研究证实，背根神经节脉冲射频可以降低由 CCI 引起的 TNF-的表达增加18。另外，趋化因子是一小分子细胞因子家族蛋白，已知某些趋化因子可以增加背根神经节和脊髓神经元的兴奋性。其中基质细胞衍生因子 SDF-1 属于趋化因子 CXC 类，CXCR4 是趋化因子基质细胞衍生因子-1（CXCL12）的特异受体。研究发现，建立神经病理性模型和癌痛模型后，在 DRG 和脊髓中均能发现 SD
26、F-1 和 CXCR4 上调19。交感神经节和 DRG 都起源于神经嵴细胞（neural crest cell，NCC），近侧的神经嵴细胞演变为 DRG，SDF-1、CXCR4 信號系统不同表达。已知趋化因子诱导神经元兴奋性增加与 TRP 通道密切相关，TRP通道拮抗剂能衰减神经源性、强直性和神经性疼痛的强烈反应。TRPV1 是 TRPV 亚家族中发现最早也是研究最为充分的一个。TRPV1 被炎性物质激活后，导致大量的 Ca2+内流，引起细胞去极化，感觉神经兴奋，触发外围感觉，最终诱导术后疼痛和慢性疼痛的形成。有研究发现，SNI20-21和 CCI22模型造成的 NP 模型中 TRPV1 表达
27、上调和 P 物质在脊髓增多等产生镇痛作用。本研究以 CCI 大鼠模型模拟人类临床所见的各种慢性疼痛的症状。本研究术前脊髓SDF-1/CXCR4 及 TRPV1 呈低水平表达，CCI 后趋化因子 SDF-1/CXCR4 及瞬时感受器电位受体 TRPV1 表达显著增加，并于损伤后的观察期内维持高水平，这与上述研究结果类似，再次证明了 SDF-1/CXCR4 及 TRPV1 参与了 NP 的形成，同时大鼠 CCI 模型血清刺激产生促炎因子 TNF-、IL-6 变化，表明炎性因子在痛阈产生中具有重要作用。因此，我们推测：PRF 后可能通过抑制 DRG 中小胶质细胞激活，抑制趋化因子表达，从而抑制交感神
28、经芽生，同时抑制 TRPV1 激活神经元，减少促炎因子释放来缓解疼痛。参考文献1 任浩，罗芳.脉冲射频治疗慢性伤害感受性疼痛的临床应用进展J.中国疼痛医学杂志，2016，22（1）：59-63.2 刘振鹏，刘娜，宫小文，等.颈 2 背根神经节脉冲射频联合硬膜外阻滞治疗难治性颈源性头痛J.中国疼痛医学杂志，2018，24（7）：557-558.3 邢倩倩，傅志俭.背根神经节脉冲射频联合腰椎侧隐窝阻滞治疗腰椎管狭窄症J.山东大学学报（医学版），2018，56（7）：76-80.4 韩健，王哲银，黎嘉雅.脊髓电刺激和背根神经节脉冲射频术治疗带状疱疹后神经痛的优劣差异J.中国医药科学，2019，9（3
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