1、课堂探究基因工程的操作离不开工具酶。限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要的条件，而载体又是将外源基因送到细胞中的必要工具。基因工程的核心是构建重组DNA分子，因此，基因工程又叫重组DNA技术。一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)1主要来源限制性核酸内切酶简称限制酶，主要存在于微生物中，多数是从细菌中分离纯化出来的。2作用限制酶能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并且能够使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。限制酶主要切割外源DNA，而对自身的DNA不起作用，以达到保护自身的目的。被限制酶切开的是磷酸二酯键，而不是碱
2、基间的氢键。3特点限制酶具有专一性，即一种限制性核酸内切酶只能特异性地识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，而且只能切割特定的位点。4结果DNA分子经限制性核酸内切酶作用后会形成DNA片段。例如从大肠杆菌中发现的一种限制性核酸内切酶只能识别GAATTC序列，并能在G和A之间将这段序列切开。限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开形成粘性末端(见上图)。此为错位切，一般是在两条链的不同部位切割，中间相隔几个核苷酸，DNA被同一种限制酶切开后形成的两个粘性末端是互补的。如下图所示，不同限制酶识别的DNA序列和切割的位点是不同的，若沿中央轴线切割，形成的是平末端。二、DNA连接酶(D
3、NA ligase)从下图可以看出，被限制酶切开的DNA两条单链的粘性末端，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对。如果将两种来源不同的DNA用同一种限制酶切割，然后让两者的粘性末端黏合起来，应该就可以合成重组的DNA分子了。但实际上仅仅这样是不够的，互补的碱基处虽然连接起来了，但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的踏板连接起来了，两边的扶手的断口处还没有连接起来。DNA连接酶能把扶手的断口处连接起来，即其能将两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来。这样可以将外源基因和载体DNA连接在一起。DNA连接酶的作用就是催化形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核苷酸连接起来。三、质粒(plasmid
4、)质粒是基因工程常用的载体，它广泛地存在于细菌中。1质粒的概念质粒是能够自主复制的双链环状DNA分子， 它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。最常用的是大肠杆菌的质粒，它含有抗生素抗性基因，如四环素的抗性基因。2载体的特点(载体应具备的条件)(1)能够在受体细胞内稳定保存和自我复制。通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。(2)具有一个或多个限制酶切位点，便于供外源DNA(目的基因)插入。最好是每种限制酶的切点只有一个。(3)具有特殊的遗传标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA
5、的鉴定和筛选。供目的基因插入的酶切位点所处的位置必须是在载体本身需要的基因之外，这样才不至于因目的基因的插入而使其失活。 (4)载体应对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。(5)载体DNA大小应适宜，以方便操作。除质粒以外，噬菌体、动物病毒和植物病毒也可作为基因工程的载体。3使用载体的目的载体是基因运输工具，在基因操作过程中，使用载体有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因送到受体细胞中去；二是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。4重组DNA分子如下图所示，科学家用一种限制性核酸内切酶切割猿猴病毒SV40的DNA和噬菌体DNA分子，再用DNA连接酶对被切开的两种DNA分子进行连接，可形成重组DNA分子。
