1、第1讲基因工程与克隆技术(基础自修课)考点一基因工程1在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、_、将目的基因导入受体细胞、_。(2)A过程需要的酶有_和_。(3)要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用_处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为_态，然后将_在缓冲液中混合培养完成转化过程。(4)含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过C_和E_。如要确保再生植株中含有抗虫基
2、因，可在C过程的培养基中加入_。(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是_。这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是_。解析：(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。(2)基因表达载体的构建过程中，需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使它们产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶把这两个DNA片段连接起来。(3)农杆菌转化法导入目的基因时，首先必须用Ca2处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态，然后将重组质粒和感受态细胞在缓冲液中混合培养完成转化过程。(4)植物组织培养过程的关键步骤是脱分
3、化和再分化。因为只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长，故若要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入卡那霉素。(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上，检测采用的方法是DNA分子杂交技术。答案：(1)基因表达载体的构建目的基因的检测与鉴定(2)限制酶DNA连接酶(3)Ca2感受重组质粒和感受态细胞(4)脱分化再分化卡那霉素(5)目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上DNA分子杂交技术2(2015福建高考)GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(
4、如下图1所示)，并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。请回答：(1)在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是_。(2)构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的_限制酶进行酶切。(3)经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有3种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。为鉴定这3种连接方式，选择Hpa酶和BamH酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如上图2所示。图中第_泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。(4)将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测G
5、DNF基因是否成功表达，可用相应的_与提取的蛋白质杂交。当培养的神经干细胞达到一定密度时，需进行_培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。解析：(1)在动物细胞培养中，胰蛋白酶的作用是使细胞分散开。(2)由图可知，在GDNF基因两侧各有一个Xho酶切位点，在载体上有一个Xho酶切位点，使用该酶既可以将GDNF基因切割下来，又可以将其插入到载体中。(3)用Hpa酶和BamH酶对3种载体进行双酶切，然后对得到的DNA分子片段进行电泳分析。对于载体自连的DNA分子来说，只有Hpa酶切位点，切割后只有一种片段，长度为6 000 bp；对于正向连接的载体来说，切割后产生两种片段6 000
6、bp和700(600100)bp；对于反向连接的载体来说，切割后产生两种片段6 500 bp和200(100100) bp。所以第泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。(4)鉴定目的基因是否成功表达，可用抗原抗体杂交法。用相应的抗体与提取的蛋白质杂交，若有杂交带，说明目的基因成功表达。当培养的细胞达到一定数量时，需进行传代培养以获得更多数量的细胞。答案：(1)使细胞分散开(2)Xho(3)(4)抗体传代3我们日常吃的大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。下面为培育转基因水稻过程示意图，请回答：(1)在上述工程中，铁结合蛋白
7、基因称为_，获取该基因后常用_技术进行扩增。(2)构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制酶分别切割_和_。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用_处理农杆菌，使重组Ti质粒易于导入。(3)将含有重组Ti质粒的农杆菌与水稻愈伤组织共同培养时，通过培养基2的筛选培养，可以获得_；培养基3与培养基2的区别是_。(4)检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻_。解析：本题中培育转基因水稻的目的是获得铁含量比普通大米高的大米，因此目的基因为铁结合蛋白基因，要大量获得此基因一般采用PCR技术进行扩增。若构建重组质粒则要用同种限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒。将外植体培养成试管苗的过程要用到不同
8、的培养基，各培养基最明显的差别在于所添加激素的比例不同。答案：(1)目的基因PCR(2)含目的基因的DNA片段质粒CaCl2(3)含有重组质粒的愈伤组织生长素和细胞分裂素的浓度比例(4)种子中铁含量4为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。其基本流程如下图(Amp表示氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因被SHH基因插入后不表达)。请回答：(1)重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，_(填“需要”或“不需要”)启动子。(2)步骤中，用Ca2处理大肠杆菌，使之成为_细胞，然后导入重组
9、载体。实验中，用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，未导入质粒的细菌将会死亡，原因是这些细菌不含有_基因。(3)能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和Xgal的培养基上会形成蓝色菌落，易于识别。根据上述原理可以初步判断_(填“蓝色”或“白色”)菌落中的大肠杆菌为重组菌。(4)将制备的探针加入角化囊肿切片中，探针将与_形成杂交带，进而判断SHH基因的转录情况。解析：(1)启动子是RNA聚合酶的识别位点，任何基因的表达(转录)均需要启动子。(2)大肠杆菌细胞用Ca2处理后就成为感受态细胞；能在添加氨苄青霉素的培养基上生存的细菌含有氨苄青霉素抗性基因，没有氨苄青霉素抗性基因的细菌将会死亡。(3
10、)能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和Xgal的培养基上会形成蓝色菌落，而重组菌中LacZ基因被SHH基因插入后不表达，重组菌在含有IPTG和Xgal的培养基上会形成白色菌落。(4)判断SHH基因的转录情况，也就是判断SHH基因是否转录出mRNA。答案：(1)需要(2)感受态Amp(或氨苄青霉素抗性或抗性)(3)白色(4)SHH转录的mRNA(只写mRNA不对) 考点一基因工程 一、抓牢主干知识这是答题的本源1比较记忆基因工程的三种工具(填表)限制酶DNA 连接酶载体作用切割目的基因和载体拼接DNA 片段，形成重组_DNA携带目的基因进入受体细胞作用部位两个核苷酸之间的磷酸二酯键作用特
11、点(条件)识别双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列在特定位点上切割Ecoli DNA 连接酶只能连接黏性末端T4 DNA 连接酶能连接黏性末端和平末端能在宿主细胞内稳定存在并大量复制有多个限制酶切割位点具有特殊的标记基因常用类型EcoR 限制酶 Sma 限制酶Ecoli DNA 连接酶、T4 DNA 连接酶质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等2熟记基因工程的四个操作步骤(填空)(1)目的基因的获取途径：方法具体操作直接分离从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取人工合成化学合成已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板逆转录法以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工
12、合成PCR技术扩增目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下延伸(2)基因表达载体的构建重组质粒的构建：表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因复制原点。启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。(3)将目的基因导入受体细胞：植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法(用Ca2处理)受体细胞受精卵、体细胞受精卵原核细胞(4)目的基因的检测与鉴定：导入检测：DNA分子杂交技术(使用DNA探针)表达检测个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验
13、。二、谨防易误陷阱这是命题的焦点判断下列叙述的正误(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列()(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因()(3)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达()(4)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列()(5)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列()(6)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶()(7)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制()(8)每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点()(9)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质()(10)将a
14、da(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada()(11)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶()(12)Ecoli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端()(13)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法()(14)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体()(15)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原抗体杂交技术()(16)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质()(17)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构()(18)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用()