1、脂蛋白脂酶及比较识别基因-58 在子痫前期胎盘中的表达及其相关性王淼赵芳菲刘春梅陈燕摘要 目的：通过检测胎盘中脂蛋白脂酶（LPL）与比较识别基因-58（CGI-58）的表达，探讨 LPL、CGI-58 与子痫前期的关系及其两项指标的相关性。方法：选取 2018 年 9月至 2019 年 7 月在我院分娩的子痫前期患者 36 例为病例组，以同期分娩的正常孕妇 40例为对照组。全自动生化分析仪检测患者分娩前 1 周内的血脂水平。运用 RT-PCR 技术检测胎盤中 LPL、CGI-58mRNA 的相对表达量。Western blotting 法检测胎盘中 LPL、CGI-58蛋白的表达水平，并分析两
2、者的相关性。结果：子痫前期胎盘组织中 LPLmRNA 的相对表达量低于对照组（t=8.431，P0.05），CGI-58mRNA 的相对表达量较对照组下降（t=6.297，P0.05）。LPL 蛋白在子痫前期胎盘中的浓度为 0.450.04，低于对照组的 0.740.10，差异有统计学意义（t=4.815，P0.05）。CGI-58 蛋白在子痫前期胎盘中浓度为 0.630.19，低于对照组的 0.870.12，差异有统计学意义（t=2.837，P0.05）。LPL 蛋白与 CGI-58 蛋白的相关表达量呈正相关（r=0.602，P=0.05）。子痫前期患者血脂中甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、载
3、脂蛋白 B、动脉粥样硬化指数较对照组升高，高密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白 A 较对照组降低，差异有统计学意义（P0.05）。结论：子痫前期孕妇 LPL 及 CGI-58 表达水平降低，二者之间的表达水平存在相关性。中图分类号R714.244文献标识码A文章编号1671-0223（2020）06-033-04子痫前期是一种妊娠期特发性疾病，其发病率约为 3%-6%，目前仍然是全球孕产妇及胎儿发病率和死亡率的主要原因1。子痫前期在发展中国家的发病率约为发达国家的 7倍，给我国医疗卫生带来巨大挑战2。目前认为子痫前期是一种多因素、多机制及多通路致病的疾病，其中胎盘病变被认为是其发病的中心环节。甘油三酯
4、脂肪酶基因家族中的脂蛋白脂酶（1ipoprotein lipase，LPL）及比较识别基因-58（CGI-58）通过脂质水解作用，在血浆及胎盘中转运脂蛋白及游离脂肪酸，对维持正常脂质代谢十分重要。本研究通过检测 LPL 和 CGI-58 在子痫前期产妇胎盘组织中的表达，探讨 LPL、CGI-58 在血脂代谢异常及子痫前期发病中的可能作用。1 对象与方法1.1 研究对象 选择 2018 年 9 月至 2019 年 7 月在华北理工大学附属医院住院分娩的子痫前期孕妇 37 例为病例组，以同期无妊娠并发症和合并症的健康孕妇 40 例为对照组。所有孕妇的孕周均在 3741 周，单胎剖宫产分娩，无烟酒、
5、吸毒不良嗜好，排除合并糖尿病、慢性高血压、心脏病、严重肝肾疾病，自身免疫性疾病，其他内分泌疾病、血液性疾病、胎膜早破和近期感染病史。子痫前期的诊断标准依据谢幸主编的妇产科学第 9版。1.2 标本采集 入院后采集次日空腹肘静脉血 3mL，离心后检测血清中的血脂浓度。在胎盘娩出 30 分钟以内，严格无菌条件下，于胎盘母体面处随机取 1 份组织，大小约111cm，注意避开栓塞及钙化部位。将胎盘组织放入灭菌的冻存管中，于液氮中保存，用于 RT-PCR 及 Western blotting 检测。1.3 主要试剂 兔抗人 LPL 单克隆抗体购自美国 Affinity Biosciences 公司;兔抗人
6、CGI-58 单克隆抗体购自武汉 ABclonal 公司;内参-actin 购自美国 proteintech 公司;蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术公司。1.4 检测方法1.4.1 血脂浓度检测由专业检验员采用迈瑞 420 型全自动生化分析仪完成。检测项目包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、载脂蛋白 A（ApoA）、载脂蛋白 B（ApoB）浓度。1.4.2 RT-PCR 法检测胎盘组织 LPLmRNA 和 CGI-58mRNA 表达从-80液氮罐中取出胎盘组织，称重后置于液氮预冷的研钵中进行研磨，并不断加入液氮，直至研磨成
7、粉末状，加入 Trizol 裂解液后提取总 RNA，用紫外分光光度计测量样品纯度及浓度。按照试剂盒说明书将 RNA 转录为 cDNA，并以此为模板进行 PCR 扩增。以肌动蛋白（-actin）为内参照，引物序列：For：5-ATATGAGATGCGTTGTTA-3，Rev：5-AAGTATTAAGGCGAAGAT-3。LPL 基因引物序列：For：5-CATAGCCTATAATTGGTTAG-3，Rev：5-GTGTAGATGAGTCTGATT-3。CGI-58 基因引物序列：For：5-ATCAAGGGTTAATCATCTCA-3，Rev：5-CTGGAATTGGTCTGTCTT-3。PCR
8、 反应过程：9510min，9515s，6020s40 循环，7230s，601min。采用 2-CT 法计算两组中 CGI-58mRNA、LPLmRNA 的相对表达量，以-actin 为内参，Ct=目的基因 Ct 值-内参基因 Ct 值，Ct=病例组Ct 值-对照组Ct 值，设对照组 2-CT 值为 1，计算病例组 mRNA 的相对表达量。1.4.3 Western blotting 法检测胎盘组织 LPL 和 CGI-58 蛋白的表达将 50mg 胎盘组织在液氮中研磨至粉末状，与 RIPA 蛋白裂解液混匀，冰盒中保存30min，4，2000g 的条件下离心 15min，收集溶解组织蛋白的上
9、清液用于 Westernblotting 检测。用 Bradford 法测定蛋白浓度。上样 15g 蛋白样品，10%聚丙烯酰胺凝胶行 SDS-PAGE 电泳，用聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride PVDF）分离蛋白。在PVDF 膜上加入兔抗人 LPL 单克隆抗体（11000）/兔抗人 CGI-58 单克隆抗体（11000），4过夜，TBST 缓冲液洗膜 3 次。加入羊抗兔 IgG 二抗（13000），室温孵育 2h，TBST 缓冲液洗膜 3 次。滴加 ECL 化学显色剂，在暗室进行曝光显影。检测各条带的光密度值，计算目的蛋白与内参蛋白的比值，作为目的蛋白的相对表达量
10、。1.5 统计学分析运用 SPSS17.0 软件包进行统计分析，正态分布的计量资料以“均数标准差”的形式表示，两组间均数比较采用独立样本 t 检验，两个变量之间的相关性采用直线相关分析，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 两组孕产妇血脂浓度的比较病例組患者血清中的的 TG 浓度、LDL-C、ApoB 较对照组升高，HDL-C、ApoA 浓度较对照组降低，差异有统计学意义（P0.05）。动脉粥样硬化指数AI=（TC-HDL-C）/HDL-C可直接反应脂代谢紊乱程度，是预测动脉粥样硬化的一种指标，病例组 AI 指数高于对照组，差异有统计学意义（P0.05），见表 1。2.2 两组孕产妇
11、胎盘组织中 LPLmRNA 和 CGI-58mRNA 表达的比较病例组胎盘组织中 LPLmRNA 相对表达量，CGI-58mRNA 的相对表达量均低于对照组，差异有统计学意义（P0.05），见表 2。2.3 两组孕产妇胎盘组织中 LPL 和 CGI-58 蛋白的表达Western blotting 印迹结果显示，LPL 蛋白及 CGI-58 蛋白在病例组胎盘中的浓度均低于对照组，差异有统计学意义（P0.05），见表 3。LPL 蛋白与 CGI-58 蛋白的相关表达量呈正相关（r=0.602，P205mg/dL、TG 浓度133mg/dL，分别较正常孕妇升高 4.16 倍、3.6 倍，LDL 浓
12、度升高 10.4%，HDL 浓度降低7%，与本研究一致。子痫前期中存在脂质代谢紊乱，可产生大量过氧化物，释放活性氧物质引起氧化应激反应，进一步造成血管舒张功能减低及内皮损伤，与子痫前期发病有关。TG 浓度升高是子痫前期的重要标志，Wojcik-Baszko 等人发现子痫前期患者的 TG 浓度较正常孕妇升高幅度更大，高甘油三脂血症可使子痫前期发病风险升高 4 倍5。目前认为 LDL 主要以氧化修饰低密度脂蛋白（OX-LDL）的形式参与动脉粥样硬化性心脑血管疾病的发病环节，高 OX-LDL 可使子痫前期的发病风险增加了 1.7 倍6。OX-LDL 可产生大量活性氧，引起氧化应激，使泡沫细胞在血管内
13、皮聚集，同时抑制内皮细胞和血小板合成前列环素，促进血栓素的形成，引起血管收缩及内皮损伤7。HDL 参与脂质代谢过程，使血清 CM、VLDL 浓度降低，阻碍胆固醇在血管壁和其他组织中的聚集，有助于清除脂质，对血管起到保护作用8。在子痫前期中，低水平的 HDL-2-C 和高水平的 TG 影响血管功能，使前列环素/血栓素比例下降，使血管紧张素-2 的敏感性增加，血压增高，导致一系列病理变化9。高胆固醇血脂，与子痫前期血脂无明显相关性，虽在 FH 杂合子女性未见早产或低出生体重高风险，且 FH 病例中子痫前期、子痫或妊娠期高血压的患病率无显著增高，但 FH 纯合子女性的妊娠大多是致命性的，且急性冠状动
14、脉事件发生率较高10。载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分，能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用。ApoE 促进子痫过脂代谢异常前期发生的机制尚不明确，可能通过脂代谢异常和炎症、凋亡反应，并与一氧化氮合酶共同作用影响子痫前期发病11。所以我们推测参与脂质代谢的关键性物质可能在子痫前期的发病中起一定作用3.2 LPL、CGI-58 在子痫前期胎盘中的表达及意义胎盘脂质转运是胎儿重要的供能方式，母体 TG 必须通过胎盘 TG 分解为游离脂肪酸进入胎盘，胎儿体内 20%-50%的脂肪酸来自母体循环12。LPL 是 TG 脂肪酶家族成员之一，主要的生理功能是水解乳糜微粒（CM）和极低密度脂蛋白（
15、VLDL）颗粒内的 TG，使之转变为小分子脂肪酸、载脂蛋白和磷脂，提供组织氧化及供能13。CGI-58 主要表达在脂肪细胞的脂滴中，可作为激动蛋白参与 TG 脂肪酶的水解过程，使其催化效率提升 20 倍14。CGI-58 与 LPL 共同参与 TG 的水解过程，其表达异常可造成胎盘脂质转运障碍，造成脂质过氧化物堆积，引起血管内皮损伤，影响胎盘的脂质代谢及能量供应。子痫前期孕妇血脂、脂蛋白代谢存在明显异常。胎盘组织化学研究表明子痫前期时胎盘梗死，胎盘中 LPL 酶活性明显下降，导致营养物质转换能力下降，影响胎儿生长发育。张春利等利用 RT-PCR 方法发现子痫前期组 LPLmRNA 表达水平显著
16、低于正常组，认为子痫前期胎盘合成 LPL 的功能降低，促使血 TG 水平升高，导致或加重了血管内皮损伤，LDL 廓清率下降，促使动脉粥样硬化发生，子痫前期形成或加重15。Aung 等16发现，富含TG 的脂蛋白引起脂解产物累积时，可激活激活转录因子 3（activated transcriptionalfactor3，ATF3），并与下游炎症分子结合（IL-1、IL-8、E 选择素、VEGF 等），继而促发内皮细胞炎症与凋亡。一项针对子痫前期基因变异的 Meta 分析发现，LPLrs268 的 G 等位基因与 LPL 活性降低和血脂异常有关，由于血脂异常可导致内皮细胞功能障碍，G 等位基因携带
17、者可能增加发生子痫前期的风险。LPL 等位基因携带者患冠心病的风险增加，LPL的 rs268 变异与不良脂质分布相关。遗传变异的存在可能导致有先兆子痫病史的妇女患心血管疾病的风险增加17。本研究中子痫前期胎盘组织 CGI-58、LPL 表达下降（P0.05），推测胎盘组织低表达 CGI-58、LPL 不仅影响全身脂质代谢水平，还与母胎界面的营养输送有关，低表达 CGI-58、LPL 可能影响胎盘浅着床、胎盘血管化，最终导致滋养层细胞浸润不足导致子痫前期发生。4 参考文献1 Dymara-Konopka W，Laskowska M，B?a?ewicz A，et al.Angiogenic imb
18、alanceas a contributor of preeclampsiaJ.Current Pharmaceutical Biotechnology，2018，19（10）：787-815.2 Malik A，Jee B，Gupta S K，et al.Preeclampsia：Disease biology andburden，its management strategies with reference to IndiaJ.PregnancyHypertens，2019，81（15）：23-31.3 Kaaja，Risto.Lipid abnormalities in pre-ecl
19、ampsia：implications forvascular healthJ.Clinical Lipidology，2011，6（1）：71-78.4 Charlton F，Tooher J，Rye K A，et al.Cardiovascular risk，lipids andpregnancy：preeclampsia and the risk of later life cardiovasculardiseaseJ.Heart，Lung and Circulation，2013，23（3）：203-212.5 Wojcik-Baszko D，Charkiewicz K，Laudans
20、ki P.Role of dyslipidemia inpreeclampsia-A review of lipidomic analysis of blood，placenta，syncytiotrophoblast microvesicles and umbilical cord artery from women withpreeclampsiaJ.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2018，139（10）：19-23.6 Viall C A，Chen Q，Liu B，et al.Antiphospholipid antibodiesinternalis
21、ed by human syncytiotrophoblast cause aberrant cell death and therelease of necrotic trophoblast debrisJ.J Autoimmun，2013，47（1）：45-57.7 Stepan H，Kley K，Hindricks J，et al.Serum levels of the adipokinefibroblast growth factor-21 are increased in preeclampsiaJ.Cytokine，2013，62（2）：322-326.8 Amiri M，Rame
22、zani T F，Rahmati M，et al.Changes over-time in bloodpressure of women with preeclampsia compared to those with normotensivepregnancies：A 15year population-based cohort studyJ.Pregnancy Hypertens，2019，17（1）：94-99.9 Vangrieken P，Al-Nasiry S，Janssen G，et al.The direct and sustainedconsequences of severe
23、 placental hypoxia on vascular contractilityJ.PLoSOne，2018，13（8）：202-209.10 Toleikyte I，Retterstol K，Leren T P，et al.Pregnancy outcomes infamilial hypercholester-olemia：a registry-based studyJ.Circu?lation，2011，124（15）：1606-1614.11 Zhou L，Hui X，Yuan H，et al.Combination of genetic markers and ageeffe
24、ctively facilitates the identification of people with high risk ofpreeclampsia in the Han Chinese PopulationJ.Biomed Res Int，2018，32（6）：437-442.12 Hirschmugl B，Desoye G，Catalano P，et al.Maternal obesity modulatesintracellular lipid turn-over in the human term placentaJ.InternationalJournal of Obesit
25、y，2016，41（2）：317-323.13陈圆圆，程蔚蔚.甘油三酯脂肪酶异常与子痫前期的相关性J.现代妇产科进展，2017，26（05）：399-400.14 Kulminskaya N，Oberer M.Protein-protein interactions regulate theactivity of Adipose Triglyceride Lipase in intracellularlipolysisJ.Biochimie，2020，16（9）：62-68.15 张春利，李东红，尹国武，等.脂蛋白脂酶基因在子痫前期胎盘中的变化及意义J.中国优生与遗传杂志，2006，14（4）
26、：23-24.16 Aung H H，Lame M W，Gohil K，et al.Induction of ATF3 gene network bytriglyceride-rich lipoprotein lipolysis products in-creases vascularapoptosisand inflammationJ.Arterioscler Thromb Vasc-Biol，2013，33（9）：2088-2096.17 Buurma A J，Turner R J，Driessen J H，et al.Genetic variants in pre-eclampsia：a meta-analysisJ.Human Reproduction Update，2013，19（3）：289-303.2020-03-26 收稿