1、第二课时无菌操作和接种技术及微生物的分离、培养与数量测定学习目标重点难点1.能说出接种技术的概念和基本过程。2能记住无菌操作的基本流程和方法。3能说出微生物分离的基本方法和操作过程。4能说出“土壤微生物的分离和计数”的操作流程。重点：1能解决在无菌操作技术中的注意问题。2会分析接种和培养大肠杆菌中出现的问题。3能解决“土壤微生物的分离和计数”出现的基本问题和操作技术。难点：能解决如何分离土壤中微生物的问题。一、无菌操作和接种技术1接种通常把在_条件下将微生物接入_的操作过程叫做接种。由于接种方法的不同，采用的接种工具也有区别，如用_进行固体培养基划线接种；用_穿刺接种；用_涂抹平板等。2无菌操
2、作_是微生物接种技术的关键。通常在酒精灯_进行接种操作，其原因是：酒精灯火焰附近的_使微生物不能存活。预习交流1根据接种工具的区别，分析有哪些接种技术。2接种过程中在接种环从菌种管中抽出时，应该注意什么问题？3无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？二、微生物的分离、培养与数量测定1分离微生物的依据分离微生物时，根据微生物对_、_、_等要求的不同，通过只提供目的微生物生长的必需条件，或加入_使_不能生长，从而达到选择分离微生物的目的。2菌落单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，可以形成肉眼可见的、有_的_，称为菌落。当_培养基表面众多菌落连
3、成一片时，便成为_。当多种微生物混杂在一起时，根据它们在平板上形成的菌落的_可初步将所需的微生物与其他微生物区分开，并在此基础上获得所需微生物的_。3分离微生物的常用方法_分离法能将单个微生物_和固定在_培养基表面或里面，每个孤立的活微生物经过_、_均可形成便于移植的菌落。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是_平板。平板分离法有多种，如_和_就是常用的两种_的方法。分离土壤中能分解纤维素的微生物所采用的培养基从功能上分是_，其特点是_。平板划线法也是常用的平板分离法。平板划线法有_、_、_、_等。在“土壤微生物的分离与计数”实验中，在高度稀释条件下，微生物在固体培养基上可以形成_，即一个菌落
4、可代表一个_，通过菌落数的统计可计算出样品中的含菌数。需准备的实验器材：灭菌处理过的移液管、试管、锥形瓶、试管架、培养皿、记号笔、烧杯、土壤样品、相关培养基、无菌水和_。选择适于分离特定微生物的培养基：利用不同微生物_的不同，可以通过选择培养基排除其他微生物的生长，从而选出所需要的特定微生物。预习交流1分类、鉴定微生物的重要依据是什么？2涂布平板法和混合平板法分离细菌和数量测定时，首先要做的操作是什么？3纤维素存在于何种细胞的何种结构中？有何功能？4自然界中的纤维素是如何被利用的？答案：一、1.无菌培养基接种环接种针玻璃刮铲2无菌操作火焰附近局部高温预习交流：1提示：微生物接种技术很多，除了最
5、常用的平板划线法和稀释涂布平板法外，还包括斜面接种、穿刺接种等方法。2提示：注意带菌部分不要触及管壁或通过火焰。3提示：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。二、1.营养成分氧气pH某些抑制剂非目的微生物2一定形态结构子细胞生长群体固体菌苔形态特征纯培养物3平板分离固体生长繁殖琼脂固体培养基涂抹平板法混合平板法定量测定选择培养基以纤维素为唯一碳源扇形划线连续划线交叉划线方格划线单个的菌落单细胞玻璃刮铲代谢特性预习交流：1提示：不同微生物在特定的培养基上生长形成的菌落或菌苔一般具有稳定的特征，可以成为对该类微生物进行分类、鉴定的重要依据。2提示：将待分离的材料进行稀释。3提示：纤维素主要存
6、在于植物细胞的细胞壁中，是植物细胞壁的主要组成成分，细胞壁越发达，纤维素的含量越多。纤维素不是一种生物活性物质，由纤维素构成的细胞壁具有保护和支持作用。4提示：自然界中的纤维素主要被土壤中的微生物分解利用；一部分被植食性动物取食利用（实质上也离不开微生物的分解作用）；一部分作为能源被人类燃烧利用。在预习中还有哪些问题需要你在听课时加以关注？请在下列表格中做个备忘吧！我的学困点我的学疑点一、无菌操作1在微生物的培养过程中为什么要进行无菌操作？怎样进行无菌操作？2下列各项中采用什么样的无菌操作？操作者的衣物、手；器皿、接种工具和培养基。微生物实验过程中许多操作都要消毒或灭菌，下列消毒或灭菌措施不恰
7、当的是（）。A接种环可用火焰灼烧B若条件优越，一些操作可在超净工作台上进行C接种后，应先进行灭菌再放入培养箱中培养D试管、培养皿等玻璃器具可用高压蒸汽灭菌1无菌操作是微生物接种技术的关键。2实验室常用的消毒或灭菌方法灭菌或消毒种类主要方法应用范围灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧接种环、接种针及试管口等干热灭菌干热灭菌箱内，在160170 加热12 h玻璃器皿、金属用具等巴氏消毒7075 下煮30 min牛奶、啤酒等一些不耐高温的液体高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，121 持续加热1530 min培养基等紫外线消毒30 W紫外线灯照射30 min接种室、超净工作台等化学药物消毒用体积分数为
8、70%75%的乙醇、碘酒涂抹等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒等二、接种与培养大肠杆菌根据教材“接种与培养大肠杆菌”回答下面的问题。1第2步中，将接种环在火焰上来回灼烧多次的目的是什么？2第3步中，迅速将试管口通过火焰23次的目的是什么？3第4步中，将灭菌的接种环先接触培养基斜面顶端等部位使其冷却，然后再挑取少许菌体的原因是什么？4平板划线法和稀释涂布平板法有何区别？下列有关接种与培养大肠杆菌操作过程的叙述，不正确的是（）。A灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养基B将试管口通过火焰23次，是为了杀灭试管口上沾染的微生物C接种结束后可直接将接种环放回原处D接种过菌种的试管，放在
9、恒温箱中（37 ）培养24 h平板划线操作（1）第一次划线及每次划线之前都需要灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养基；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。（2）灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。（3）划线时最后一区域不要与第一区域相连。（4）划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。三、土壤微生物的分离和计数1教材P17表12的培养基配方中，为微生物的生长提供碳源和氮
10、源的分别是什么物质？该培养基是液体培养基还是固体培养基？2实验中如何设置对照实验？3第4步中，每个浓度设置3个重复的目的是什么？4想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克土壤样品中的细菌数？下列有关“土壤微生物的分离和计数”实验的说法，错误的是（）。A该实验采用了唯一氮源为尿素的鉴别培养基B将培养皿倒置于恒温箱中37 培养C计算时，选取菌落数在30300的一组为代表，进行统计D每次用无菌移液管吸取土壤悬液前都要振荡该实验中的注意事项（1）设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。（2）对照原则判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的培
11、养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。四、分离土壤中能分解纤维素的微生物阅读教材P19旁栏中的纤维素分解菌选择培养基的成分回答下列问题。1旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？2这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，是如何进行选择的？纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有（）。ANH4NO3 BNaCl C酵母浸膏 D微晶纤维素粉刚果红染色法鉴别纤维素分解菌的原理刚果红（Congo Red，简称CR）是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后
12、的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。答案：活动与探究一：1提示：无菌操作的目的是防止受到空气中的杂菌污染。培养微生物用的试管、培养皿和微生物培养基等，在接种之前都需要灭菌；接种操作时要在酒精灯火焰附近的无菌区进行。2提示：清洁消毒；进行灭菌。迁移与应用：C解析：接种用具、器皿、空气中都充满了微生物，都有污染的可能，必须严格地消毒灭菌。A、B、D三项措施都是合理可
13、行的。但接种后再灭菌会将菌种杀死导致实验失败。活动与探究二：1提示：杀灭接种环上的杂菌。2提示：杀灭试管口上沾染的微生物。3提示：防止接种环过热将细菌杀死。4提示：这两种方法都是分离微生物的方法。二者的操作方法不同，平板划线法是挑单个菌落在琼脂固体培养基表面划线，将微生物分离；稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。平板划线法主要用于分离纯化，稀释涂布平板法主要用于计数。迁移与应用：C解析：接种过菌种的试管，应放在恒温箱中（37 ）培养24 h。接种结束后，灼烧接种环后，放回原处。活动与探究三：1提示：碳源：葡萄糖，氮源：尿
14、素；因配方中含有凝固剂琼脂，该培养基为固体培养基。2提示：另设置一份不加氮源（以等体积的无菌水代替）的对照。3提示：增加实验结果的说服力与准确性。4提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计三个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后根据公式（每克土壤样品的细菌数某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数稀释倍数）进行计算。迁移与应用：A解析：土壤微生物的分离和计数实验中采用的是以尿素为唯一氮源的选择培养基。活动与探究四：1提示：是固体培养基，因为配方中有凝固剂琼脂。2提示：有选择作用，本配方中的唯一碳源是微晶纤维素粉，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。迁移与应用：D解析：在以纤维素为唯一碳源
15、的培养基上，只有分解纤维素的微生物能够正常生长而其他微生物不能正常生长，对微生物起选择作用。1无菌操作包括以下几个方面的叙述，其中错误的是（）。A对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌B将培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌C为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行D实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触2用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（）。A未接种的选择培养基 B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D接种了的选择培养基3在涂布平板操作时错误的是（）。A将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红，为防止微生物再次污染，
16、不需冷却可直接在平板上涂抹B取少量菌液滴加在培养基表面C将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却810 s再用D涂布时可转动培养皿，使涂布均匀4下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是（）。A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上C将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养2448小时D确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数5以纤维素为唯一碳源筛选出多种具有较高纤维素降解能力的微生物，其中有真菌和细菌，试分析此类微生物在生态系统中的作用与下列哪种
17、生物类似（）。A硝化细菌B蓝藻 C蚯蚓 D兔子答案：1A解析：对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒而不是灭菌。2C解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，应选牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一样接种、培养。3A解析：涂布平板时，首先要对涂布器进行灭菌处理，方法是把沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上点燃，冷却后使用；然后把0.1 mL的菌液滴加到平板上，用涂布器涂布均匀。如果涂布器在酒精灯火焰上灼烧直到烧红，不经冷却，则涂布器的温度很高，在使用时就会杀死要接种的细菌。4D解析：本题考查的
18、是土壤微生物总数的计数，所以培养所使用的培养基就应该是标准培养基，并要经过高压蒸汽灭菌处理；涂布时要对样本的水溶液进行稀释，一般选取104、105、106倍的土壤稀释液各0.1 mL进行涂布，为了检查平板培养基是否制备合格，要同时把一培养基接种少量无菌水，以作空白对照；培养一段时间后，如果平板上菌落个数在30300之间，即可把该组所有平板的菌落计数，然后取其平均值，即可计算出土壤细菌的总数。而D项是菌落数在300以上，故D项错。5C解析：纤维素分解菌能把纤维素分解为葡萄糖，并利用葡萄糖，在生态系统中属于分解者。蚯蚓生活在泥土中，以土壤中腐烂的有机物为食物，在生态系统中属于分解者。硝化细菌、蓝藻为自养型生物，在生态系统中属于生产者。兔子以植物为食，在生态系统中属于消费者。用精练的语言把你当堂掌握的核心知识的精华部分和基本技能的要领部分写下来，并进行识记。知识精华技能要领