1、苦皮藤对类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞增殖和相关细胞因子表达的影响陈彦伶何金英胡成刚唐娟莫雅蜜朱睿香【摘 要】目的：觀察苦皮藤不同提取部位对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）增殖的影响，及其对肿瘤坏死因子-（TNF-）诱导的 HFLS-RA 中细胞因子表达的影响。方法：制备苦皮藤水提物（A）及其醇提物（B），对醇提物根据极性大小进行萃取，得到石油醚部位（C）、二氯甲烷部位（D）、乙酸乙酯部位（E）、正丁醇部位（F）、剩余层部位（G）。噻唑蓝（MTT）法检测苦皮藤各部位不同浓度（10、20、40、80、160g/mL）干预细胞 24h、48h、72h，对细胞增殖的抑制作用;TNF-（2
2、0ng/mL）体外诱导 HFLS-RA 增殖，加入不同浓度的各个提取部位（10，40，160g/mL）作用 72h后，酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞上清中白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、前列腺素 E2（PGE2）的含量。结果：MTT 结果表明，苦皮藤的 B、C、D（80，160g/mL）能显著抑制 HFLS-RA 细胞的增殖（P0.01），呈时间和剂量依赖性;A、E、F、G 四组对细胞的活力均无明显影响。ELISA 结果显示，与空白组比较，TNF-组细胞上清中 IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2 含量均显著提高（P0.01）
3、;与 TNF-组比较，B、C、D（40，160g/mL）能显著抑制 IL-1的表达（P0.05，P0.01），具有剂量依赖性;C（40，160g/mL）能显著抑制 IL-6 的表达（P0.05），D（160g/mL）能显著抑制 IL-6 的表达（P0.05）;C、D（160g/mL）能显著降低 MMP-3 含量（P0.05）;A、B、D（160g/mL）可抑制 PGE2 的表达（P0.05），C（40、160g/mL）能显著抑制 PGE2 的表达（P0.05，P0.01）。结论：苦皮藤可抑制HFLS-RA 增殖及其分泌 IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2 的能力。【关键词】苦皮藤;类风湿
4、关节炎;类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞;肿瘤细胞因子-;细胞因子【中图分类号】R285.5【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2020）4-0014-07Effects of Celastrus Angulatus on Human Rheumatoid Arthritis FibroblastSynovial CellsProliferation and Expression of Related CytokinesCHEN Yanling HE Jinying HU Chenggang*TANG Juan MO Yami ZHU RuixiangGuiyang College o
5、f Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，ChinaAbstract：Objective To observe the effects of different extracts fromCelastrus angulatuson the proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells（HFLS-RA）and their effects on the expression ofcytokines in HFLS-RA induced by tumor ne
6、crosis factor-（TNF-）.MethodsThe water extract（A）and alcohol extract（B）were prepared，and thealcohol extract was extracted according to polarity to obtain petroleum etherextract（C），dichloromethane extract（D），and ethyl acetate extract（E），Butanol extract（F），residual layer extract（G）.The MTT method wasus
7、ed to detect the inhibitory effects of various extraction sites（10、20、40、80and 160 g/mL）on the cell proliferation for 24h、48hand 72h.HFLS-RAwere induced in vitro by using TNF-（20ng/mL），and treatment withdifferent concentrations（10，40，160 g/mL）for 72 hours，The enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）w
8、as used to detect the contents ofinterleukin-1（IL-1），interleukin-6（IL-6），matrix metalloproteinases-3（MMP-3），and Prostaglandin E2（PGE2）in the cell supernatant.Result TheMTT results showed that B，C，and D（80，160 g/mL）significantly inhibitedproliferation of HFLS-RA（P0.01）in a time-dependent and dose-dep
9、endentmanner.The four groups A，E，F and G had no significant effect on cellviability.ELISA results showed that compared with the blank group，the levelsof IL-1，IL-6，MMP-3，and PGE2 in the supernatant of the TNF-group weresignificantly increased（P0.01）;Compared with the TNF-group，B，C，D（40，160 g/mL）can s
10、ignificantly inhibit the expression of IL-1（P0.05，P0.01），which is dose-dependent;C（40，160 g/mL）cansignificantly inhibit the expression of IL-6（P0.05），D（160 g/mL）cansignificantly inhibit the expression of IL-6（P0.05）;C and D（160g/mL）significantly reduced the content of MMP-3（P0.05）;A，B，D（160g/mL）can
11、inhibit PGE2 expression（P0.05），C（40，160 g/mL）can significantly inhibit the expression of PGE2（P0.05，P0.01）.Conclusion C.angulatus can inhibit HFLS-RA proliferation and its ability tosecrete IL-1，IL-6，MMP-3，and PGE2.Key words：Celastrus Angulatus;Rheumatoid Arthritis;Human Fibroblast-like Synoviocyte
12、Rheumatoid Arthritis;Tumornecrosisfactor-;Cytokines类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种以关节滑膜炎及自身抗体分泌为特点的慢性自身免疫性疾病1，其病因及发病机制比较复杂。研究认为，炎症、滑膜增生及骨破坏为 RA 主要的病理特征，治疗时可从抑制炎症反应、抑制滑膜细胞增殖、抑制软骨损伤和骨侵蚀几方面入手2-3。滑膜成纤维细胞（Fibroblast-Likessynoviocytes，FLS）在 RA 发病中起关键作用，在病理状态下 FLS 表现为异常增殖及凋亡不足，能分泌高水平促炎细胞因子，如 TNF-、IL-1、I
13、L-6、IL-17，还能分泌化学趋化因子、基质蛋白降解酶等4。苦皮藤 Celastrus angulatus Maxim.为卫矛科南蛇藤属苦皮藤的干燥根，具有祛风除湿、活血通经、解毒杀虫的功效，可治疗风湿痹痛、骨折伤痛、疮疡溃烂等病5-6。苦皮藤中化学成分丰富，含有倍半萜类、三萜类、二萜类、黄酮类、生物碱类、挥发油等成分7。苦皮藤具有杀虫、杀菌、抗癌等活性，其中杀虫活性研究较为深入，已有成熟的杀虫制剂8。但关于苦皮藤抗风湿作用的研究在国内外尚无具体报道。根据文献记载9，苦皮藤配伍藤萝根、白金条泡酒服用可治疗风湿、劳伤、关节疼痛。由此，为验证苦皮藤的抗风湿作用，寻找其有效成分及其作用机制，可对苦
14、皮藤进行深入研究。实验以TNF-诱导的人类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞模型，研究苦皮藤不同提取部位的抗风湿作用，为筛选苦皮藤抗风湿有效部位及研究其作用机制提供科学依据。1 材料1.1 细胞株 HFLS-RA 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（货号：JNO-02001），购自广州吉妮欧生物科技有限公司。1.2 药物制备 称取 8mg 药物，充分溶于 1mL DMSO 中，制成 8mg/mL 的母液，用0.22m 的微孔滤膜过滤，4条件下保存。1.3 试剂 胰酶（+EDTA，批号：J180035，Hyclone）;南美胎牛血清（批号：JC63468，CLARK）;DMEM 高糖培养基（批号：WH0111
15、1903XP，Procell）;双抗（批号：J180034，Hyclone）;MTT（批号：EZ2811A179，Biofroxx）;二甲基亚砜（DMSO，批号：SHBJ7919，Sigma）;TNF-（货号：300-01A-10，Peprotech）;IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2 檢测试剂盒均购自上海茁彩生物科技有限公司。1.4 仪器 倒置生物显微镜（AE31，麦克奥迪实业集团有限公司）;酶标仪（SpectraMAX Plus384，Molecular Devices）;压力蒸汽灭菌器（SYQ-DSX-280B，上海宜川仪表厂）;CO2 培养箱（MCO-15AC，三洋电机国际贸易
16、有限公司）;台式低速离心机（TDZ4-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司）。2 方法2.1 MTT 法检测苦皮藤对 HFLS-RA 增殖活性的影响 取对数生长期的 HFLS-RA 细胞，PBS 洗涤，胰蛋白酶消化后收集，1000rpm 离心 5min，吸除上清液，加入适量培养基使其成为单细胞悬液，调节细胞密度 3.5104/mL，200L/孔接种于 96 孔板中，每种药物分别设置空白对照组、160、80、40、20、10g/mL 组，每组 5 重复，37、5%CO2 恒温培养，待细胞贴壁后，加入对应药物。待药物分别作用 24、48、72h 后，吸弃上清，每孔加入 200L 终浓度为 0.5mg/
17、mL 的 MTT 溶液，继续培养 4h;吸弃液体，每孔加入 150LDMSO，避光振荡 10min，用酶标仪测定其在 490nm 处的吸光度（OD）值，计算细胞的生存率。2.2 ELISA 法检测 TNF-诱导的 HFLS-RA 中相关细胞因子的表达 取对数生长期的HFLS-RA 细胞，PBS 洗涤，胰蛋白酶消化收集，1000rpm 离心 5min，吸除上清液，加入适量培养基使其成为单细胞悬液，调节细胞密度 7104/mL，2mL/孔接种于 24 孔板中，24h细胞贴壁后弃去上清液，设置空白组、模型组、样品组，每组 3 重复。空白组不加药物及TNF-，模型组用不完全培养基培养预处理 1h 后，
18、加入 1mL 20ng/mL 的 TNF-，样品组分别加入质量浓度为 10、40、160g/mL 的 7 种不同药物 1mL，预处理 1h 后，再加入 1mLTNF-，37、5%CO2 恒温培养，72h 后收集上清液，按 ELISA 试剂盒说明书检测 IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2 的含量。2.3 统计学处理 采用 SPSS 20.0 统计学软件进行统计学分析。计量资料满足正态分布以（xTX-*3s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用最小显著差（LSD）法，以 P0.05）;其余各组差异均有统计学意义（P0.05，P0.05）;其余各组差异均有统计学意义（P0.0
19、5，P0.05）;其余各组差异均有统计学意义（P0.05，P0.01）。各组随着给药浓度增加，对细胞增殖均出现不同程度的抑制作用，并呈剂量依赖性，其中 C、D 组（160g/mL）对 HFLS-RA 的增殖有明显抑制作用（见图4）。石油醚部位作用 24h、48h、72h 的 IC50 值分别为 156.38、75.044、61.347g/mL，二氯甲烷部位作用 48h、72h 的 IC50 值分别为 94.571、63.513g/mL，其余部位无法获取IC50。在 ELISA 实验中采用高、中、低（160、40、10g/mL）3 个剂量来考察苦皮藤各个部位对相关细胞因子的影响。3.2 苦皮藤对
20、 HFLS-RA 分泌细胞因子的影响3.2.1 苦皮藤对 IL-1的影响 由表 1 可知，与空白组比较，TNF-组细胞上清中IL-1含量极显著升高（P0.01）。与 TNF-组比较，B、C、D 组（40，160g/mL）中IL-1含量均明显降低（P0.05，P0.01），且各组对 IL-1的作用呈一定的浓度依赖关系;E 组（160g/mL）中 IL-1含量极显著降低（P0.01）。3.2.2 苦皮藤对 IL-6 的影响 由表 2 可知，与空白组比较，TNF-组细胞上清中 IL-6含量极显著升高（P0.01）。与 TNF-组比较，C 组（40，160g/mL）中 IL-6 含量均明显降低（P0.
21、05），呈一定的浓度依赖关系;D 组（160g/mL）中 IL-6 含量显著降低（P0.05）。3.2.3 苦皮藤对 MMP-3 的影响 由表 3 可知，与空白组比较，TNF-组细胞上清中MMP-3 含量极显著升高（P0.01）。与 TNF-组比较，C、D 组（160g/mL）中 MMP-3 含量均明显降低（P0.05）。3.2.4 苦皮藤对 PGE2 的影响 由表 4 可知，与空白组比较，TNF-组细胞上清中 PGE2含量极显著升高（P0.01）。与 TNF-组比较，C 组（40，160g/mL）中 PGE2 含量显著降低（P0.05，P0.01），呈一定的浓度依赖关系;A、B、D 组（16
22、0g/mL）中 PGE2 含量均明显降低（P0.05，P0.01）。4 讨论研究认为，滑膜成纤维细胞（FLS）在炎症反应的发展和关节破坏过程中起着重要作用，能直接破坏软骨和骨组织，是治疗 RA 的重要靶点10。FLS 可合成并分泌肿瘤细胞因子、白细胞介素、干扰素、趋化因子、集落刺激因子、生长因子等多种因子，如 IL-6、IL-8、PGE2、胶原酶、基质金属蛋白酶等，这些炎症介质均参与滑膜炎症反应并最终导致关节破坏11。本实验通过研究苦皮藤对 HFLS-RA 细胞增殖及分泌炎症因子的抑制能力，初步分析苦皮藤抗风湿有效部位及可能机制。MTT 法检测苦皮藤对细胞增殖活性的影响实验表明，随着时间延长及
23、给药浓度增加，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余层部位对细胞的增殖均无明显抑制作用;石油醚部位与二氯甲烷部位对细胞的抑制率逐步升高，呈时间和剂量依赖性，当给药浓度为 160g/mL，干预 72h 时抑制率最高，抑制效果最佳，抑制率分别达到 90.701%、91.318%。ELISA 法检测苦皮藤对细胞分泌炎症因子含量的影响实验表明，TNF-可诱导HFLS-RA 分泌高水平的 IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2，体现其促炎功能。石油醚部位及二氯甲烷部位（160g/mL）能显著抑制相关细胞因子的表达（P0.05，P0.01），提示这两个部位可能通过抑制 HFLS-RA 分泌细胞因
24、子，从而减少炎症因子的产生与释放;其余部位均没有明显的抑制作用。综上，苦皮藤中具有抑制 HFLS-RA 增殖及其分泌炎症因子能力的有效成分集中在石油醚部位及二氯甲烷部位。苦皮藤中富含萜类成分，主要集中在小极性部位12。研究表明，萜類成分具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等广泛的生物活性13-14。其中倍半萜类化合物可通过抑制 NF-B，MAPKs 和 STAT 等信号通路相关因子的活化，下调 TNF-、PGE2、NO、IL-1、IL-6、IL-8 等炎性因子的蛋白表达，实现抗炎作用15。由此推测苦皮藤抗风湿作用可能与萜类成分相关，尚待进一步实验验证。综上所述，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及
25、剩余层部位对细胞增殖及相关细胞因子的表达均无明显抑制作用;石油醚部位与二氯甲烷部位可抑制 HFLS-RA 的异常增殖，并能够显著降低 IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2 的表达水平，为下一步探究苦皮藤抗风湿有效成分及其作用机制奠定基础。参考文献1刘肃，张鑫，王春生.类风湿性关节患者血清炎性细胞因子水平及其临床意义分析J.基因组学与应用生物学，2018，37（9）：4100-4105.2B.AUID-ORCID HTTP ORCID ORG X.WILLIAMS，A.DHARMAPATNI，T.CROTTI.Intracellular apoptotic pathways：a potential target for reducingjoint damage in rheumatoid arthritisJ.Inflammation Research，2018，67（3）：219-231.