1、渔用配合饲料中左旋肉碱含量的测定马瑞欣 李同庆 张志华摘要：建立了亲水作用色谱-串联质谱法（HILIC-MS/MS）检测渔用配合饲料中左旋肉碱含量的方法。样品用超纯水超声提取提取液稀释后经 HILIC 色谱柱分离以乙腈和乙酸铵（含 0.15%甲酸）溶液为流动相梯度洗脱三重四级杆串联质谱多反应监测（MRM）方式扫描外标法定量。结果表明左旋肉碱在 0.2100 ng/mL 范围线性良好（r0.999）;检出限 0.5g/kg 定量限 1.5 g/kg。在 20、50 和 100 mg/kg 添加水平下回收率为 75.2%111%相对标准偏差 RSD 为 3.4%9.9%（n=6）。该方法前处理简单
2、、快速定性定量准确适合于渔用配合饲料中左旋肉碱的准确定性定量。关键词：亲水作用色谱-串联质谱;左旋肉碱;渔用配合饲料左旋肉碱（L-carnitine）是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸广泛分布于自然界是生物体的基本成分其中肉类和乳制品中左旋肉碱的含量最高而蔬菜和水果类左旋肉碱的含量最低1-2。水产动物自身能在肝脏和组织中合成左旋肉碱但在幼体时期体内合成的肉碱远远不能满足水产动物快速生长的需要此时其饲料中必须添加一定量的左旋肉碱3。近年来国内外就左旋肉碱对水产动物生长性能的研究表明：左旋肉碱能明显提高鱼类增长速度提高饲料蛋白质的效率降低饲料系数提高鱼肉品质提高养殖成活率和繁殖率3-5。文献中有关
3、左旋肉碱的检测方法有很多6研究样品多数为血浆7-8、乳制品9-11、尿液12、食品1-2，13、保健品14-15、减肥产品16-17等，未见到有关饲料中左旋肉碱的检测方法报道。笔者建立了亲水作用色谱-串联质谱法（HILIC-MS/MS）检测渔用配合饲料中左旋肉碱含量的方法该方法通过液相色谱柱分离质谱选择离子的方法进行定性和定量减少了干扰可快速准确地检测渔用配合饲料中左旋肉碱的含量。1 实验部分1.1 仪器、试剂与材料LC-20AD 液相色谱（日本岛津）;QTRAP 4500 三重四极杆质谱仪（美国 AB SCIEX）;十万分之一电子天平（赛多利斯 CPA225D）;千分之一电子天平（赛多利斯
4、CP323S）涡旋振荡器（IKAMS3-digital）;高速离心机（安徽科大创新股份有限公 HC-3518）;中草藥粉碎机（天津泰斯特 FW135）。左旋肉碱对照品（北京索莱宝科技有限公司纯度98%）;实验所用超纯水由 Milli-Q超纯水机制备;正己烷（色谱纯 Honeywell）。一次性针式滤器（Pall25 mm0.22 m）。1.2 实验条件1.2.1 色谱条件色谱柱 GOLDHILIC（50 mm2.1 mm1.9 umThermoscientific 公司）流动相 5 mmol/L 乙酸铵（含 V/V 0.15%甲酸）（A）和乙腈（B）;梯度洗脱：01min 98%B;1 min
5、3 min 98%B10%B;3 min3.1 min 10%B98%B;3.16 min98%B。流速 0.5 mL/min;柱温 40;进样体积 2 L。1.2.2 质谱条件电离模式：ESI+多反应离子检测（MRM）模式;喷雾电压 5 500 V;气帘气 40 PSi;碰撞气 Medium;离子源温度 550;雾化气（GS1）55 PSi;辅助加热气（GS2）55 PSi;去簇电压 60 V;碰撞池出口电压（CXP）6.0 V。左旋肉碱母离子为 m/z162.0;定性离子对为 m/z 162.085.0 碰撞能 26 eV;定量离子对为 m/z 162.0103.0 碰撞能 22 eV。1
6、.3 样品前处理饲料经粉碎机粉碎后称取 1.000 g 于 50 mL 离心试管中加入 10 mL 超纯水涡旋振荡 2min 超声提取 20 min4 000 r/min 离心 10 min，上清液倒入 25 mL 比色管中;再加入 10mL 超纯水重复提取一次合并上清液用超纯水定容至 25 mL。取 3 mL 上清液于 10 mL 离心试管中加入 3 mL 正己烷涡旋 30 s10 000 r/min 离心 10 min 去掉上层正己烷层取下层清液过 0.22 m 滤膜后用超纯水稀释 200 倍供上机测试。2 结果与讨论2.1 色谱柱的选择实验中考察了左旋肉碱在 Hypersil gold
7、C18Accucore aQ，ZORBAX RX-C8 和Kinetex F5Hypersil GOLD HILIC 色谱柱上的保留和分离能力。结果表明左旋肉碱在Hypersil gold C18Accucore aQ 和 ZORBAX RX-C8 上不保留在死时间出峰。在 Kinetex F5上保留较差出峰时间 0.94 min 且峰形极差;在 Hypersil GOLD HILIC 色谱柱上能够得到峰形尖锐的色谱峰。这是因为左旋肉碱为小分子极性化合物在弱极性 C18 和 C8 填料的反相色谱柱上不保留。亲水作用色谱（HILIC）采用极性固定相有机溶剂-水相缓冲液为流动相能有效地保留反相色谱
8、中保留不完全或不保留的强极性样品并具有良好的分离效果18。2.2 流动相的选择实验中考察了甲醇和水、乙腈和水、乙腈和乙酸铵溶液（含 V/V0.15%甲酸）作为流动相时左旋肉碱在 Hypersil GOLD HILIC 色谱柱的洗脱分离情况。结果表明：使用甲醇和水作为流动相洗脱时保留时间 0.27 min 峰形扩散严重响应很低;使用乙腈和和水作为流动相洗脱时保留时间合理但峰形拖尾严重;使用乙腈和乙酸铵（含 V/V0.15%甲酸）溶液作为流动相洗脱时峰形尖锐响应明显提高对称性增强。这是由于对 HILIC 色谱甲醇的洗脱能力强于乙腈且甲醇增加了分离的不确定性和较差的峰形18。因此在 HILIC 中一
9、般采用乙腈-水作为流动相。水相中加入一定比例的乙酸铵和甲酸可以提高离子化效率改善峰形。故选用乙腈和乙酸铵（含 V/V0.15%甲酸）溶液作为流动相进行梯度洗脱。标准溶液的 HILIC-MS/MS 谱图见图 1。2.3 质谱条件的确定将 1.0 g/mL 的标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪通过优化去簇电压、碰撞能等参数确定定性离子对为 m/z 162.085.0 和 m/z 162.0103.0m/z 162.0103.0 为定量离子对。2.4 样品前处理条件的确定左旋肉碱易溶于水所以本实验中采用水作为提取剂。考察水、0.2 mol/L 盐酸溶液、0.2%乙酸溶液的提取结果发现测试结果无差别所以采用
10、超纯水作为提取剂直接提取。由于左旋肉碱广泛分布于自然界是生物体的基本成分。它在植物性饲料干物质中的含量要低于其在动物性饲料中的含量但都在几几百 mg/kg 数量级范围4。由于质谱的灵敏度高为防止对质谱造成污染同时为降低基质效应和保证测试液落在线性范围内对提取液进行了 200 倍稀释后上机测试。2.5 基质效应本方法为外标法采用了稀释和减小进样量的方法来减小基质效应。由于左旋肉碱天然存在无法获得饲料空白样品。本文取适量已知含量的稀释前提取液添加一定量（体积尽可能小）的标准溶液和适量超纯水使得最终得到的溶液中提取液稀释 200 倍且添加浓度和原浓度保持基本相当。通过上机测试由标准曲线给出提取液添加
11、标准溶液前后左旋肉碱的含量。通过比较添加标准溶液前后左旋肉碱的含量变化来考察基质效应。实验中利用三种饲料考察了基质效应结果见表 1。基质效应=1-2/（0+1）100%。基质抑制呈现鳖饲料鲫鱼饲料锦鲤饲料的现象与饲料中动物源性成分的含量一致。由于基质抑制75%见表 2 故本测定方法忽略基质效应。2.6 标准溶液的配制、标准曲线和检出限用十万分之一的电子天平称取适量标准品用超纯水溶解并定容配制成 100 g/mL 的储备液用超纯水逐级稀释成 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 ng/mL 的标准系列按浓度由低到高进 LC-MS/MS 测试以左旋肉碱定量离子对 m/z
12、 162.0103.0 的峰面积 y对质量浓度 x 做标准曲线得到线性方程 y=6.469 26 x 104x+35 475.1 相关系数 r=0.99973。根据鳖饲料、鲫鱼饲料和锦鲤饲料中左旋肉碱的信噪比得出检出限为 0.5 g/kg 定量限为 1.5 g/kg。由于不同试样中所含的左旋肉碱含量水平有差异如果测定结果超出了本方法的线性范围需对样品溶液稀释后再测定。2.7 精密度和回收率称取鳖饲料、鲫鱼饲料、锦鲤饲料三种饲料样品各 12 份 6 份做本底 6 份做标准溶液添加。按照本文建立的方法进行前处理和测定考查方法的回收率和精密度结果见表 2。2.8 实际样品的测定用本文建立的实验方法对
13、客户的 6 份样品进行测定测定值分别为 562、51、168、360、466、288 mg/kg 与客户预期值一致。实际样品的色谱图见图 2。3 结论本研究建立了亲水作用色谱-串联质谱法测定渔用配合饲料中左旋肉碱的分析方法。该方法前处理简单精密度高、定性定量准确适合于渔用配合饲料中左旋肉碱的准确定性定量。参考文献：1 Demarquoy J，Georges B，Rigault C，et al.Radioisotopicdetermination of L-carnitine content in foods commonly eaten in WesterncountriesJ.Food Ch
14、emistry，2004，86（1）：137-142.2 Knttel-Gustavsen Seline，Harmeyer Johein.The determination of L-carnitine in several food samplesJ.Food Chemistry，2007，105（2）：793-804.3 李海軍，邵庆均，聂月美.L-肉碱在水产动物中的应用J.饲料工业，2006，27（10）：56-58.4 胡梦红，王有基.新型水产饲料添加剂-左旋肉碱J.现代渔业信息，2006，21（6）：18-20.5 阿迪力江阿布都热合曼.左旋肉碱在畜牧业生产中的应用研究J.甘肃畜牧兽
15、医，2015，45（11）：39-40.6 马兴，高云，崔颖，等.左旋肉碱检测方法研究进展J.食品安全质量检测学报，2015，6（2）：399-404.7 丁峰，朱秋毓，顾勇，等.高效液相色谱法测定血浆游离肉碱J.药物分析杂志2005，250（10）：1195-1197.8 唐笑，黄凯，杨淇龄，等.高效液相色谱法检测罗非鱼血浆中 L-肉碱的方法研究J.水产及科学，2018，37（3）：354-360.9 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.婴幼儿食品和乳品中左旋肉碱的测定：GB 29989-2013S.北京，中国标准出版社，2013：1-3.10 唐吉旺，袁列江，肖泳，等.高效液相亲水作用
16、色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中胆碱和左旋肉碱的含量J.理化检验-化学分册，2019，55（6）：621-625.11 刘艳明，薛霞，刘国强，等.亲水作用色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中左旋肉碱J.色谱，2015，33（9）：943-945.12 Laurence Vernez，Grard Hopfgartner，Markus Wenk，etal.Determination of carnitine and acylcarnitines in urine byhigh-performanceliquid chromatography electrospray ionization io
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19、649-657.Abstract：An analytical method was developed for the determination of L-carnitine in fish formula feed by using hydrophilic interactionchromatography-tandem mass spectrometry（HILIC-MS/MS）.The samples wereextracted with ultrapure water by ultrasonic.The separation of L-carnitinewas carried out
20、 on a Hypersil GOLD HILIC column using ammonium acetate（0.15%formic acid）and acetonitrile as mobile phases.The quantification analysisof the target compound was performedunder multiple reaction monitoring（MRM）mode by external standard method.A good linear relationship wasobtained between the peak ar
21、ea and concentration of L-carnitinein the rangeof 0.2100 ng/mL with the correlation coefficient more than 0.999.The limitof detection（LOD）was 0.5 g/kg and the limit ofquantification（LOQ）was 1.5 g/kg.At spiked levels of 20，50 and 100 mg/kg，therecoveries ranged from 75.2%to 111%，and the relative stand
22、arddeviation ranged from 3.4%to 9.9%.The sample preparation was simple andrapid，and the resultswere accurate.The developedmethod is suitablefor the determination of L-carnitine in in fish formula feed.Key words：hydrophilic liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HILIC-MS/MS）;L-carnitine;fish formula feed（收稿日期：2020-04-26）
