1、庖丁巧解牛知识巧学一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”基因工程的“分子手术刀”指的是DNA限制性核酸内切酶(以下简称限制酶)。限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定部分的两个核苷酸之间“切割”DNA分子。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了二百多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因就能被某种限制酶切割下来。疑点突破限制性内切酶识别序列和切开部位有何特点？限制酶所识别的序列，大多数是由6个核苷酸组成，也有少数识别序列由4、5或8个核苷酸组成，但都可以找到一条
2、中轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的；任何一种限制酶因其本身性质所决定，都只识别和切断特定的核苷酸序列，而不是在任何部位都能将DNA切开。要点提示 当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA两条链分别切开时，产生的是黏性末端；在中轴线处切开时，产生的是平末端。二、DNA连接酶“分子缝合针”被限制酶切开的黏性末端，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对。可以设想，如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性末端黏合起来，似乎就可以合成重组的DNA分子了。但是，实际上仅仅这样做是不够的，互补的碱基处虽然连接起来，但是这种连接只相当于把断成两截的梯子中间的
3、踏板连接起来，两边扶手的断口处还没有连接起来。要把扶手的断口处连接起来，也就是把两条DNA末端之间的缝隙“缝合”起来，还要靠另一种极其重要的工具DNA连接酶。辨析比较DNA连接酶和DNA聚合酶有何异同点？ 相同点：两者都是催化形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成）；都由蛋白质构成。不同点：（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键，也不是连接互补碱基之间的氢键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，
4、将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上（不能连接单链DNA）的两个缺口同时连接起来。因此，DNA连接酶不需要模板。三、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”要将一个外源基因送入受体细胞，还需要有运输工具，这就是运载体。作为运载体的物质必须具备以下条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。目前，符合上述条件并经常使用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌染色体DN
5、A的百分之一。质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都有质粒。因为土壤农杆菌很容易感染植物细胞，所以科学家培育转基因植物时，常常用土壤农杆菌中的质粒作运载体。难点剖析作为基因工程中的“分子运输车”载体，应具备以下条件：（1）必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上；（2）载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；（3）必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选；（4）必须是安全的，不会对受体细胞有害
6、，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去；（5）大小应合适，太大则不易操作。问题探究问题1如何准确理解基因工程的含义？探究：（1）它是一种按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的技术；（2）在DNA分子水平进行操作；（3）是体外进行的人为的基因重组；（4）一旦成功，便可遗传；（5）主要技术为体外DNA重组技术和转基因技术。问题2基因操作过程中，只用到限制性内切酶和DNA连接酶吗？探究：在基因操作过程中，除了以上两种酶以外，还要用一系列其他酶类，才能完成全过程。例如，碱性磷酸酯酶、末端转移酶、逆转录酶等，这些酶都有各自特殊的功能，可以根据不同的需要选用。任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸
7、序列，这是由限制酶的性质所决定的。DNA连接酶是将一段DNA片段3端的羟基与另一DNA片段5端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键。典题热题例1 下列有关基因工程的叙述，不正确的是()A.基因工程又叫做重组DNA技术B.对生物的基因进行改造或重新组合，定向改造生物的遗传性状C.在医药卫生、农牧业和环境保护等方面有广泛的应用D.可对任何物种进行改造，控制生物的进化解析：基因工程又叫重组DNA技术或基因拼接技术，可以定向地改造生物的遗传性状，但是无法改造物种，更不可能控制生物的进化。答案：D误区警示基因工程可以对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖
8、，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。但是无法改造物种，更不可能控制生物的进化，不能人为地夸大基因工程的作用。例2 下列关于限制酶的说法，正确的是()A.限制酶广泛存在于各种生物中，微生物中很少分布B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键解析：此题主要考查限制酶的有关知识。限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，并不是广泛存在于各种生物中；一种限制酶能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA分子经限制酶切割会形成黏性末端和平齐末
9、端两种。答案：B例3 下列有关质粒的叙述，正确的是()A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状的细胞器B.质粒是细菌细胞中能自主复制的小型环状DNA分子C.质粒只有在侵入宿主细胞后才能复制D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的解析：质粒是一个小型的环状DNA分子，它可以进入细菌细胞，存在于细胞内，但它不是宿主细胞的细胞器。质粒是一个重要的运载体，通常利用质粒与目的基因结合，形成重组质粒，而后导入细菌细胞。答案：B拓展延伸作为载体必须具备三个条件：（1）能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；（2）有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；（3）具有某些标记基因，以便进行筛选。质粒具备以上三
10、个条件，且是基因工程中最常用的运载体。例4 关于质粒和染色体的叙述，正确的是()A.两者有相同的化学本质B.两者是同一物质的不同形态C.质粒不存在于真核细胞中，染色体普遍存在于真核细胞中D.两者的化学成分中均含有脱氧核糖解析：质粒是存在于细菌、酵母菌等微生物细胞中的小型环状DNA分子，染色体是真核生物细胞核中主要由DNA和蛋白质组成的物质。答案：D例5 下列关于基因工程的叙述，正确的是()A.基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B.细菌质粒是基因工程常用的运载体C.通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA，用另一种处理载体DNAD.为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体解析：细菌质粒是基因工程中常用的运载体。A项中抗菌素抗性基因应为标记基因，而不是目的基因。C选项应该用同一种限制酶，以保证同样的末端。D选项在选择受体细胞时，主要考虑的是该细胞中目的基因是否表达。由于受精卵全能性最高，所以往往成为动植物实施转基因的首选，但也可以导入其他细胞，例如，植物胚的细胞、动物囊胚早期细胞等。答案：B