1、课题1微生物的实验室培养1知道培养基的种类、营养要素及配制原则。(重点)2掌握消毒、灭菌的原理和方法。(重点)3学会配制培养基和纯化大肠杆菌的方法。(重、难点)培 养 基 及 无 菌 技 术1培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。(2)种类：按物理性质分(3)营养组成：各种培养基一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质(如维生素、氨基酸和碱基等)以及氧气的要求。2无菌技术(1)无菌技术的目的是防止外来杂菌的入侵。主要内容包括：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁
2、和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。(2)消毒和灭菌：消毒灭菌概念使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌适用对象操作空间、操作者双手等接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等探讨：虽然各种培养基的具体配方不同，但是一般都含有哪些成分？提示：虽然各种培养基的具体配方不同，
3、但一般都含有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。另外，还必须满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。探讨：对培养基、培养皿、接种环、实验者的双手、空气和牛奶常采用的灭菌或消毒方法分别是什么？提示：分别为高压蒸汽灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌、化学消毒、紫外线灭菌、巴氏消毒法。探讨：无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。1 培养基的成分及功能营养物质作用功能主要来源碳源能为微生物代谢提供碳元素构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉
4、饼、石油等氮源能为微生物的代谢提供氮元素合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子是生长必不可少的酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水是生命活动所必需的不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定外界摄入无机盐为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂无机化合物2.培养基的配制原则(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加
5、入缓冲剂，常用磷酸氢二钾磷酸二氢钾。3几种常用灭菌和消毒方法的比较灭菌和消毒种类主要方法应用范围巴氏消毒法7075 煮30 min或80 煮15 min牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧微生物接种工具；如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等干热灭菌干热灭菌箱160170 加热12 h玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品高压蒸汽灭菌100 kPa、121 维持1530 min培养基及多种器材、物品煮沸消毒法100 煮沸56 min家庭餐具等生活用品的消毒紫外线消毒30 W紫外灯照射30 min接种
6、室空气化学药物消毒用体积分数为70%75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒1关于灭菌和消毒的不正确的理解是()A灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B消毒和灭菌实质上是相同的C接种环用灼烧的方法灭菌D常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌等【解析】消毒是指用温和的理化方法杀死体表或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)，灭菌则是用强烈的理化因素杀死体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。【答案】B2空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的
7、分布情况。实验步骤如下：配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；制作无菌平板；设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；将各组平板置于37 恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题：(1)该培养基中微生物所需的氮来源于_。若要完成步骤，该培养基中的成分X通常是_。(2)步骤中，实验组的操作是_。(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_现象。【解析】(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤，需要进行倒平板操作，用到
8、的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。【答案】(1)牛肉膏、蛋白胨琼脂(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间(3)污染大 肠 杆 菌 的 纯 化 培 养1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基(1)(2)培养基应采用高压蒸汽灭菌；倒平板时要待培养基冷却至50_左右时，在酒精灯火焰附近进行，等平板冷凝后将平板倒置。2纯化大肠杆菌(1)纯化培养的原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来
9、的肉眼可见的菌落，即获得较纯的菌种。(2)纯化培养方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上纯化大肠杆菌，最常用的方法有平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。释释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。(3)培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37_恒温箱中，培养12 h和24 h后，分别记录观察。(4)菌种保存：临时保藏法甘油管藏法适用对象频繁使用的菌种长期保存的菌种培养基类型固体斜面培养基液体培养基温度4 20 方法菌落长成后放入冰箱中保存，
10、以后每36个月将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后放在冷冻箱内保存缺点菌种易被污染或产生变异探讨：接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？提示：(1)划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。(2)划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。探讨：在倒平板时为何要在酒精灯的火焰旁进行？提示：酒精灯的火焰旁是无菌区域，在酒精灯的火焰旁操作，可以避免周围环境中微生物的污染。探讨：接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面是否有菌落生
11、长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。1微生物培养中有关实验操作的注意事项(1)倒平板操作：培养基要冷却到50 左右时开始倒平板。其原因是琼脂是一种多糖，在98 以上熔化，在44 以下凝固，倒平板时高于50 则会烫手，低于50 时若不能及时操作，琼脂会凝固。要使锥形瓶的瓶口通过火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养
12、基。平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。(2)平板划线操作：第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。灼烧接种环之后，要等其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样才能
13、使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。划线时最后一区域不要与第一区域相连。划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。(3)稀释涂布平板操作：稀释涂布平板法操作比较复杂，且各个细节均需保证无菌操作，应特别注意：稀释操作中的每支试管及其中9 mL的水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰12 cm处。酒精灯与培养皿的距离要合适。吸管头不要接触任何其他物体。吸管要在酒精灯火焰周围使用。2平板划线法和稀释涂布平板法的比较优点缺点适用范围平板划线分离法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌稀释涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量
14、较少、较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌1制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程中，关于倒平板的具体描述正确的是()等培养基冷却至40 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰用左手的拇指和食指打开皿盖右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上皿盖等待平板冷却510 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上ABC D【解析】培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板；将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿盛有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞；用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是打开
15、皿盖；等待平板冷却510 min后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。改正后的步骤为倒平板的具体操作。【答案】C2平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。下列相关叙述中错误的是()A平板划线法要求要连续多划几次，且除了第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的终点B除了第一次划线需要将接种环灼烧灭菌外，以后的划线可以不用灭菌即可划线C如果菌液本来浓度不高，则可以适当降低稀释倍数D充分稀释和连续划线的目的都是为了使形成的菌落是由单一的细菌繁殖而成【解析】平板划线法需要连续划线的目的就是使得细菌的浓度降低，所以除了第一次划线外，以后的每次划线的起点是上一次划线的终点，A正确；为了
16、防止被杂菌污染，每一次划线前要将接种环都进行灼烧灭菌，B错误；稀释倍数要随菌液的浓度而定，如果菌液的浓度太大，则需要更高的稀释倍数，否则就可以适当降低稀释的倍数，C正确；稀释涂布平板法中的充分稀释及平板划线法中的连续划线，目的都是为了保证菌落是由单一的细菌繁殖而成，D正确。【答案】B3为了保存菌种的纯净需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是()A对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法B临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上C临时保藏菌种容易被污染或发生变异D对于需要长期保存的菌种，可以采用低温4 保藏的方法【解析】对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在3 mL甘油瓶中
17、加入1 mL的甘油后灭菌，将1 mL的菌液转移到甘油瓶中，放在20 的冷冻箱中保存。【答案】D1在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确顺序为()溶化调pH加棉塞包扎分装称量A BC D【解析】上述步骤中，培养基的配制顺序为称量溶化调pH分装加棉塞包扎。【答案】B2下列关于四种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的描述，其中正确的一组是()项目硝化细菌乳酸菌酵母菌衣藻能源氧化NH3分解乳酸固定N2利用光能碳源CO2糖类糖类CO2氮源NH3N2N2NO代谢类型自养需氧型异养需氧型异养需氧型自养需氧型A.硝化细菌、乳酸菌B乳酸菌、酵母菌C酵母菌、衣藻D硝化细菌、衣藻【解析】本题考查的知识有：各种微生
18、物的代谢类型，微生物所需的能源、碳源和氮源的不同。解答此题时应明确：硝化细菌、乳酸菌属于细菌，酵母菌属于真菌，衣藻属于真核生物。微生物所需的能源、碳源、氮源因其同化作用类型的不同而不同。【答案】D3无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是() 【导学号：05520012】A对培养操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌B对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌C为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行D实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触【解析】灭菌是采用强烈的理化因素对用于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基进行处理，使物体内外一切微生物，包括芽孢和孢子都
19、被杀死；实验操作者的衣着和手以及操作空间只能进行消毒。【答案】A4细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀死哪些部位的杂菌()A接种环、手、培养基B高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环D接种环、手、高压锅【解析】高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌；用酒精擦拭双手是消毒的一种方法；火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。【答案】C5下列关于平板划线操作的叙述正确的是()A使用已灭菌的接种环、培养皿，在操作过程中不再灭菌B打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞C打开培养皿盖，将沾有菌种的接
20、种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可D最后将平板倒置，放在培养箱中【解析】在平板划线操作中，已灭过菌的接种环在每次划线后都必须用灼烧灭菌法再次灭菌，以防杂菌污染；盛有菌种的试管在打开后或重新塞棉塞前，都需将试管口通过火焰进行灼烧灭菌；划线过程中，培养皿盖应打开一条缝隙，进行接种，接种完毕后，迅速盖上培养皿盖，以防杂菌污染；将平板放入培养箱培养时需倒置，主要是为了防止培养皿盖上的水珠落在培养基上，造成污染。故选D。【答案】D课堂小结：网络构建核心回扣1.培养基的成分一般包括水、碳源、氮源、无机盐，除此之外，还应满足微生物对pH、特殊营养物质及氧气的需求。2.获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。3.消毒和灭菌的区别是后者更彻底，将物体表面及内部所有微生物包括芽孢、孢子全部杀死。4.微生物培养中常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，前者操作简单，后者可用于微生物计数。5.实验室常用的消毒方法有煮沸消毒法，巴氏消毒法和使用紫外线或化学药剂进行消毒，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。6.固体培养基的配制过程为：计算称量溶化灭菌倒平板。
