1、专题5 DNA与蛋白质技术课题5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段庖丁巧解牛知识巧学 一、PCR原理1.多聚酶链式反应（又称PCR技术）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2.用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制过程类似。要点提示 DNA的两条链是反向平行的。为了明确表示DNA的方向，通常将DNA的羟基末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3端延伸DNA链。辨析比较 DNA聚合酶和DNA连接酶（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端
2、的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 （2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。3.在80100 范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。疑点突破 Taq DNA聚合酶是从Thermus aquaticus菌提取的热稳定
3、性酶，分子量大约为94 kDa。这种酶的天然形式可在74 复制DNA， Taq DNA聚合酶在镁存在的条件下可催化核苷酸沿53方向发生聚合反应，形成双链DNA。二、PCR的反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。1.变性当温度上升到90 以上时，双链DNA解聚为单链。2.复性温度下降到50 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。3.延伸温度上升到72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。要点提示 PCR的反应过程和DNA的复制过程的区别：体外DNA进行、不需解旋酶、条件不同。PCR反应需要在
4、一定的缓冲溶液中提供：DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA的复制在体外反复进行。三、实验操作1.用微量移液器，按照下列配方在微量离心管中依次加入各组分PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5 L20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1 L20 mmol/L的引物2.5 L20 mmol/L的引物2.5 LH2O2833 L15 U/mL的Taq DNA聚合酶12 U模板DNA510 L总体积50 L2.参照下表的设置设计好PCR仪的循环程序循环数变性复性延伸第1次94 ,10 min30次94 ,30 s55 ,30 s72 ,1 mi
5、n最后1次94 ,1 min55 ,30 s72 ,1 min问题探究 问题1 PCR技术怎样扩增DNA?探究:待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA链的两端序列实现特异性复性结合。此时，两引物的3端相对，5端相背，扩增的片段由5端向3端延伸。在适当的pH和离子强度下，由TaqDNA聚合酶催化引物的延伸。上述反应过程是通过温度控制来实现的。热变性复性延伸的一个周期过程称为一个PCR循环。PCR全过程就是在适当条件下的这种循环的多次重复。首次PCR中延伸的产物在进入第二次循环变性后，再与引物互补，充当引导DNA合成的新模板。因此，第二轮循环后，模板由首轮循环后得到的4条增为8条（包括
6、原始模板在内），以此类推，以后每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。从理论上讲，扩增DNA产量可呈指数上升，即n个循环后，产量为2n拷贝。问题2 引物的特点是什么？思路:引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。探究:（1）引物长度：1530 bp，常用为20 bp左右。（2）引物扩增跨度：以200500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段。 （3）引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不
7、配对而导致PCR失败。（4）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。典题热题例1关于PCR引物的下列说法，不正确的是（）A.引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA的互补链合成的（脱氧）核苷酸序列B.引物常根据需要扩增的目标DNA的碱基序列用化学合成的方法获得C.DNA聚合酶只能使DNA链从引物的3端开始向引物的5端延伸D.引物的3端必须具有游离的-OH基团解析：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；延伸DNA链是从5端向3端延伸。答案：C例22002年4月，以杭州华大基因研究中心和浙江大学生物信息研究中心为主体的中国科学家协会成功破译了水稻基因的信息。下图1表示DNA测序仪显示的碱基序列，则图2中显示的碱基序列为（）A.AGGTTB.ATTGGC.TAAGGD.TGGAA解析：本题为信息题，通过分析图1可知由上到下代表的是脱氧核苷酸序列，数字代表的是脱氧核苷酸的种类。答案：B
