1、专题5 DNA与蛋白质技术课题5.3 血红蛋白的提取和分离一、【课题目标】（一）知识与技能1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理（二）过程与方法体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤（三）情感、态度与价值观 初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神二、【课题重点】凝胶色谱法的原理和方法三、【课题难点】 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填四、【教学方法】 启发式教学五、【教学工具】 多媒体课件六、【教学过程】（一）引入新课蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对
2、生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？（二）进行新课1基础知识蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。11凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：（图513a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程：（图513b）混合物上柱洗脱大分子流动快、小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。12缓冲溶液（1）原理
3、：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3NaHCO3，HCNaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。13凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。思考阅读教材后，填写下表：决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的
4、SDS，形成“蛋白质SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。2实验设计2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。2.2选择实验材料（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：血液由 和 两部分组成。血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。该化合物是由 和 构成的，其中每个
5、亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。红细胞的洗涤过程为血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液
6、体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：红细胞破碎混合液中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH7的磷酸缓冲液中。思考：为何使用pH7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量
7、？维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤粗分离（凝胶色谱操作）。2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。根据教材图519，说出制作色谱柱需要的材料。橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞安装色谱柱下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：色谱柱的装填过程。步骤操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上计算称量
8、凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀凝胶颗粒洗脱液沸水浴装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h样品加入和洗脱。其基本过程是：调节缓冲液面加入蛋白质样品调节缓冲液面洗脱收集分装蛋白质至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。（2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。（三）课堂总结、点评（四）实例探究例1 利用凝胶色谱法，什么
9、样的蛋白质先洗脱出来（ ）A.相对分子质量大的B.溶解度高的C.相对分子量小的D.所代电荷多的解析：凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。答案：A例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定解析：蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为实
10、验操作过程中的技术答案：C综合应用例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。答案：D（五）巩固练习1.凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（ ） A.对其他分子的亲和力 B.溶解度 C.所带电荷多少 D.相对分子质量的大小2.凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大
11、多是（ ） A.糖类化合物 B.脂质 C.蛋白质 D.核酸3.选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（ ） A.血红蛋白是有色蛋白 B.红细胞无细胞核 C.红细胞蛋白质含量高 D.红细胞DNA含量高4.将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ） A.甲苯 B.血红蛋白水溶液 C.脂溶性物质的沉淀层 D.其他杂质的沉淀5.血红蛋白因含有（ ）而呈红色 A.O2 B.CO C.CO2 D.血红素6.下列操作正确的是（ ） A.分离红细胞时采用低速长时间离心 B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可 C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓
12、冲液，透析12h7.样品的加入和洗脱的叙述正确的是（ ） A.先加入1ml透析后的样品 B.加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出 C.如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功 D.洗脱时可以用缓冲液也可以用清水8.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ） A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D.可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度9.凝胶色谱法操作正确的是（ ） A.将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B.将橡皮塞下部切出凹穴 C
13、.插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D.将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片10.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ） A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内 C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 D.用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面答案：1. D 2.A 3.A 4.D 5.D 6.D 7.C 8.B 9.A 10.D七、【课余作业】1、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？2、与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质的分离和提取有什么意义？八、
14、【教学体会】本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让薛生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法九、【资料袋】凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。