1、专题2 微生物的培养与应用课题2.3 分解纤维素的微生物的分离庖丁巧解牛知识巧学 一、纤维素与纤维素酶纤维素是地球上最常见的多糖，其组成元素是C、H、O，纤维素的基本组成单位是葡萄糖，这一点和淀粉是相同的，但是由于和淀粉的结构不同，它们的物理化学性质也大不一样。淀粉进入人体后能在淀粉酶和麦芽糖酶的作用下彻底分解成葡萄糖，用于各项生命活动；而纤维素在人体内不能被消化吸收，但是它可以促进人体肠胃的蠕动，增加排便次数，因此对人体健康是极为有利的。纤维素酶是一种复合酶，由三部分组成：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，只有在这三种酶的协同作用下，纤维素才能彻底分解成葡萄糖。动物细胞中都没有纤维素，也没有纤维素
2、酶，因此纤维素不能被动物直接利用。知识拓展 纤维素酶可以作为畜禽的饲料添加剂，其作用机理在于它可以打破植物的细胞壁，使胞内的原生质暴露出来，由内源酶进一步降解。这样除了细胞壁能分解供能外，胞内物质的消化利用率也得到了提高，从而有效地提高了饲料的利用率。误区警示 草食动物并不能直接利用植物体内的纤维素，它们能以植物为主要食物的原因是其胃中生活着一些微生物，这些微生物能分泌纤维素酶，将纤维素分解成葡萄糖，被动物利用，同时它们也能从动物体内获得各种养料，因此它们和动物是共生关系。二、纤维素分解菌的筛选一般情况下，我们都是先用选择培养基对土壤中的纤维素分解菌进行粗筛，然后用刚果红染色法进行细筛，刚果红
3、是一种酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水和酒精，它能把胶质和纤维素染成红色，当纤维素被酶分解后，刚果红纤维素复合物就无法形成，从而在固体培养基上形成一个以菌落为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来鉴别有无纤维素分解菌的存在。疑点突破 纤维素分解菌的选择培养基是液体培养基，和固体培养基相比，它有利于营养物质的充分利用，并可以增加纤维素分解菌的浓度。只有能够产生纤维素酶的微生物才能分解纤维素作为碳源和能源，其他微生物由于不能利用纤维素，会因缺乏碳源和能源而死亡，因此该培养基具有选择作用。三、实验设计：分离分解纤维素的微生物1.土壤取样在富含纤维素的潮湿的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土，
4、迅速铲取土壤并装入无菌信封，密封。2.选择培养将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养12天(如果没有摇床，可以采用定时人为摇晃锥形瓶的办法)，直至培养液变混浊。吸取一定量的培养液(如5 mL)，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变混浊。吸取适量的培养液，稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。对照组用同样量的富集后的培养液，稀释涂布到不含纤维素的培养基上。3.梯度稀释用l mL无菌吸管从富集培养后的培养液中吸取l mL，注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使之充分混匀；然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL
5、注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成101、102、103、104、105、106倍的各种稀释液。4.涂布培养在含鉴别培养基的三个平板上分别用记号笔标记：104、105、106倍的三种稀释液，另取三个不含纤维素的培养基平板，分别用记号笔标记：104、105、106倍的三种稀释液；然后用三支l mL无菌吸管分别从104、105、106倍的三管稀释液中吸取0.1 mL对号放入已标记了稀释度的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。将培养基平板倒置于3037 的温室中培养12天，每隔24 h观察菌落情况。5.筛选菌株（1）刚果红染色法常用的刚果红（Congo Red，简称CR
6、）染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mgmL的CR溶液，1015 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为1 molL的NaCl溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。方法二:配制质量浓度为10 mgmL的CR溶液，灭菌后，按照每200 mL培养基加入1 mL的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。实验组经刚果红染色法，菌落周围将会出现明显的透明圈，而对照组，不含纤维素的培养基经刚果红染
7、色法，菌落周围不出现明显的透明圈。辨析比较 两种刚果红染色法的比较。刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培
8、养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。（2）挑菌从产生明显的透明圈的菌落上挑取部分细菌并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在3037 培养，可获得较纯的菌种。知识拓展 纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。葡萄糖分子中有还原性醛基，能与斐林试剂发生颜色反应，颜色的深浅和葡萄糖的浓度有关，可以利用这个原理来定量测定葡萄糖的浓度。问题探究问题1阅读下面材料，谈谈纤维素对人体的作用。在过去很长的一段时间里，很多人都将食物中的膳食纤维视为食物中的渣滓，并将它们随口吐出。但近年来，随着食品化学、微生物等学科的迅猛发展，科学家终于发现膳
9、食纤维不仅对人体大为有益，而且还是一种天然抗病防病与强身的有益物质。所谓膳食纤维，指的就是来自植物性食物中的纤维素与半纤维素，它们在人体消化道中不会被酶所分解。但肠道中的细菌可利用这些纤维素进行发酵，从而大大增加粪便的体积。膳食纤维可分为两类，即水溶性纤维（如果胶、苹果纤维和燕麦纤维等）和水不溶性纤维（如大豆纤维、半纤维素和大麦纤维等）。水溶性纤维遇水会膨胀或变成透明凝胶状物质，在肠道内更容易被肠道菌发酵和利用。膳食纤维的主要来源是蔬菜、杂粮和水果。因此，食物过分精细者或经常以高脂肪、高蛋白食品为主要食物者常因膳食纤维摄入不足而诱发相关疾病，如果在主食中搭配部分杂粮，并经常吃新鲜蔬菜和水果，即
10、可保证有足够量的膳食纤维摄入。经常吃富含膳食纤维食品的人，可大大降低结肠癌和直肠癌的发病率。更重要的是，高纤维素食物还有助于预防发生高血压、高血脂、冠心病、糖尿病和乳腺癌。对于中老年人来说，肉和脂肪性食品应尽量少吃，但富含膳食纤维的食品，如芹菜、番茄、卷心菜与黄瓜等却多吃为佳。水果也是十分重要的膳食纤维来源，尤其是香蕉、苹果、橘子和葡萄。营养学家的研究发现，中老年人吃水果以多样化为宜，这样可保证体内有充分的膳食纤维摄入。吃水果的另一好处是，水果普遍含有钾元素与叶黄素、白藜芦醇和花青素等营养成分，它们有降血压，防止动脉硬化，保护视网膜黄斑，防止老年性视力退化以及预防癌症等作用；多吃水果还有防止便
11、秘的作用。思路:在营养严重缺乏的情况下，纤维素对人的有利作用不很突出，但是当饮食趋于精细化、高“营养”化后，可结合上述材料和生活经验，探讨纤维素对维持人体健康的重要的作用。探究:在物质文明高度发达的现在，人们的生活水平普遍较高，这对于维持人体的健康无疑是大有裨益的，但是物极必反，“文明病、富贵病”的逐年增加为人们的健康提出了新的挑战。虽然纤维素不能被人体直接利用，但它有以下作用：（1）增加饱腹感，减少热量摄入，有利于减肥。（2）增加排便次数，避免粪便在肠道堆积，能大大减少直肠癌的发病率。（3）能吸收水分，软化粪便，减少便秘的几率。（4）能及时吸收肠道的有毒物质，随粪便排出体外。（5）能增强某些
12、食物的口感。问题2根据纤维素酶的作用，想一想纤维素酶在工农业生产中都有哪些作用。思路:纤维素酶能将纤维素水解为葡萄糖，因此凡是有关纤维素降解的工农业过程都可能用到纤维素酶。地球上每年光合作用约产生1.51011吨植物材料，其中50为纤维素。这些植物多聚糖为数量巨大的真菌和细菌提供能源，也为人类提供了巨大的能量来源。但这些材料需转换成葡萄糖、乙醇、甲烷等低分子物质后才能被利用。用纤维素酶水解的方法与化学方法相比有许多好处，尤其体现在避免环境污染上。纤维素酶，还可用于淀粉处理、动物饲料生产、果菜汁提取等食品工业、饲料工业、造纸工业及纺织工业等。探究:纤维素酶能把纤维素水解成葡萄糖，在工农业生产中有
13、重要的利用价值。（1）在农牧业上的应用：它可以用作饲料添加剂，提高动物饲料的利用率。（2）在纺织业上的应用：在解析纤维含量和种类、褪浆处理、生物磨光、石磨等方面。（3）在造纸业上的应用：广泛用于旧纸的脱墨处理。（4）在其他方面的应用：生产葡萄糖、生产食品添加剂、生产木聚糖。典题热题例1下列生物能分解纤维素的是（）人兔牛蘑菇纤维杆菌A.B.C.D.解析：动物和人的细胞都不能合成纤维素酶，因此都不能直接利用纤维素，兔、牛等草食动物之所以能长期吃草是因为其肠道内有分解纤维素的微生物，蘑菇、纤维杆菌都能分泌纤维素酶从而利用纤维素。答案：C拓展延伸 细菌和真菌对纤维素的分解情况不太相同，细菌的纤维素酶一
14、般结合在细胞膜上，因此只有它吸附在纤维素上时才能分解纤维素；真菌的纤维素酶是胞外酶，不需要菌体和纤维素直接接触就能将其分解。例2从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，所用的培养基是（）A.加富培养基B.完全培养基C.基础培养基D.鉴别培养基解析：从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，接种土壤稀释液后，微生物生长时若产生蛋白酶，则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈，从而鉴别出该类菌的存在。答案：D辨析比较 选择培养基和鉴别培养基是不同的，选择培养基要求在培养基中加入某种物质，抑制不需要的微生物生长，促进需要的微生物生长，从而选育出某种微生物；鉴别培养基要求在
15、培养基中加入某种物质，鉴别某种微生物是否存在（一般是根据某种颜色反应），这里不需要抑制其他微生物的生长。例3分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是（）稀释倒平板法涂布平板法单细胞挑取法选择培养基分离A.BC.D.解析：分离土壤中纤维素分解菌时，先进行选择培养，增大纤维素分解菌的浓度，即富集培养，梯度稀释后涂布平板、培养，最后单细胞挑取以获得纯培养。答案：B误区警示 稀释倒平板法和涂布倒平板法是不同的。前者是先进行梯度稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50 左右的琼脂培养基混合、摇匀后，倾入灭菌的培养皿中，制成可能含菌的琼脂平板，保温一定时间即可出现菌落。后者是先将熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品液涂布在整个平板表面，经培养后形成单个的菌落。例4分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是（）A.经选择培养后直接将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B.富集培养这一步可省略，但获得的纤维素分解菌的菌落较少C.经稀释培养后，用刚果红染色D.对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上解析：经选择培养后，再经稀释才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明得到的是纤维素分解菌。答案：A