1、选修1专题2课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题目标1.知识目标了解有关选择培养基的基础知识。2.能力目标a.用涂布平板计数法进行微生物数量测定。b.设计对照实验。3.情感目标形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯。二、课题重点对土样的选取和选择培养基的配制。三、课题难点对分解尿素的细菌的计数。四 教学流程教学流程教师活动学生活动设计意图环节一：课程导入从教材课题背景导入，展示课题目标。背景材料：1.尿素的利用:尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。2.细菌利用尿素的原因：土壤中的含脲酶的细菌能够分解尿素。课题目标：1.从土壤中分离出能够
2、分解尿素的细菌2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌阅读、倾听。情景导入本节目标。环节二：讲授新课1.知识目标 （一）筛选菌株1.实例以PCR技术为例，引导学生探究问题的解决方法。PCR技术：一种在体外将少量DNA大量复制的技术。此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。提出的问题如何寻找耐高温的DNA聚合酶？ 解决问题的思路寻找耐高温环境。原因：高温条件淘汰了绝大多数微生物。获得启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2.实验室微生物的筛选原理引导学生根据上面实例归纳实验室微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻
3、止其他微生物生长。 3.选择培养基 （1）让学生分析本课题使用的培养基成分，回答问题。KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 .7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。问题1：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？碳源：葡萄糖、尿素；氮源：尿素。问题2：此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。（2）共同归纳选择培养基概念允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。（3）举例说明选择培
4、养基作用加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。（二）统计菌落数目1.显微镜直接计数引导学生回忆血细胞计数板计数相关知识，讲解显微镜直接计数的原理、做法、优缺点。（1）原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。（2）做法：每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。（3）优缺点：优点：能准确统计微生物的实际数目。缺点：不能区分死菌和活菌。2.间接计数（活菌计数法）引导学生回忆稀释涂布平板法
5、相关知识，讲解稀释涂布平板法计数的原理，以例题讲解计数方法和设置重复组的重要性。（1）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）计数：【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ ） A.2.34108B.2.34109 C.234D.23.4【答案】B【解析】稀释倍数为106，0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1106=2.34109。计
6、算公式：每克样品中的菌落数(CV)MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(m)，M代表稀释倍数。【例2】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值。 【方法点
7、拨】 稀释涂布平板法计算注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。设置对照1.目的讲解设置对照目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。2.实例分析让学生分析教材实例，设置对照。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下
8、只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学结果有问题，可能是A同学培养基被杂菌污染，或者培养基混入其他含氮物质，导致其他杂菌生长。但A同学认为自己选用土壤样品不同导致结果不同，但是A同学没有设计对照，拿不出让同学信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响因素吗？方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案2：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。二、实验设计指出土壤中分解尿素的细菌的分离与记数步骤：1.土壤取样；2.制备培养基
9、； 3.样品稀释、取样涂布；4.微生物的培养、观察并记录结果；5.细菌的计数。 逐步讲解各个步骤方法和注意事项。1.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 2.制备培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。 选用稀释倍数为103107的稀释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。 3.样品稀释、取样涂布因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当
10、有针对性地提供选择培养的条件。 测定土壤细菌数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。 将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。 注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。4.微生物的培养、观察
11、并记录结果将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在3037的温度下培养12d；放线菌一般在2528的温度下培养57d；而霉菌一般在2528的温度下培养34d。 一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如菌落形状、大小、隆起程度和颜色。5.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 三、操作提示
12、指导学生阅读教材操作提示部分，明确目的。(一)无菌操作1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 (二）做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。（三）规划时间 提高效率，在操作时更加有条不紊。【典型例题】 下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是()A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板 B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布到不同平板上培养C.将实验组和对照组平板倒置，37 恒
13、温培养2448小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数【答案】D【方法点拨】一般选择菌落数在30300间的平板进行计数 四、结果分析与评价以三个问题为例，让学生进行结果分析与评价。（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选菌落。对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已经筛选出一些菌落。（二）样品的稀释操作是否成功。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30 300平板，说明稀释比较成功，并能够进行菌落的计数。（三）重复组的结果是否一致。如果选取的是同一种土样，统计结果应该相近。如果结
14、果相差太远，需要分析产生差异原因。五、课题延伸讲解：本课题对能分解尿素的细菌进行初步筛选。对分离的菌种进一步鉴定，需要借助生物化学方法。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨 。氨会使培养基的碱性增强 ，PH 升高 。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红 ，说明该细菌能够分解尿素 。阅读、思考、回答。分析、回答。回忆、分析、回答。演练、回答、归纳。设计对照实验。阅读、倾听、思考、回答。阅读、回答。演练、回答。分解、评价。了解选择培养基相关知识。用涂布平板计数法
15、对分解尿素细菌计数。设计对照实验。进行实验设计。进行结果分析和评价。环节三：课堂小结共同回顾本节要点： 一、选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源 。二、鉴定方法： 在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素 。三、统计菌落数目的方法 （1）显微镜直接计数法 （2）间接计数法（稀释涂布平板计数法）计算公式 ：每克样品中的菌株数(CV)M 操作：设置重复组，选择菌落数30300的平板进行计数。（3）设置对照 证明培养基未被污染，用空白培养基作对照。 证明选择培养基的选择作用：用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。 呼应、回答。突出本节重点。环节四：课堂练习下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中，正确的是()A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素 B.筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质C.统计样品中的活菌数目时一般用平板划线法D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌【答案】A【方法点拨】1.筛选分解尿素的细菌的实验中，采用的是以尿素为唯一“氮源”的培养基。2.统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法。 3.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，这样就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 演练、回答。突出重点。